在现代生物医学成像领域，荧光显微技术已成为揭示细胞和分子动态过程的核心工具。传统基于荧光强度的成像方法虽然直观，但往往受限于荧光染料浓度、光漂白效应以及环境淬灭等因素，导致信号易受干扰，无法精确反映分子微环境的变化。为克服这些局限，荧光寿命成像显微镜（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM）应运而生。它通过测量荧光分子的激发态寿命（荧光寿命），提供了一种独立于浓度的成像对比机制，能够更深入地探究分子相互作用、pH值、氧浓度、黏度等生理参数。
时间相关单光子计数（Time-Correlated Single Photon Counting, TCSPC）技术，正是实现高精度FLIM的核心方法。该技术利用脉冲激光激发样品，借助单光子探测器精确记录每个发射光子相对于激发脉冲的到达时间。通过多次重复激发-发射循环，构建光子到达时间直方图，最终拟合出荧光衰减曲线，实现皮秒级的时间分辨率和近乎理想的光子计数效率。
TCSPC FLIM 将TCSPC与激光扫描显微镜相结合，不仅保留了TCSPC的高灵敏度和时间分辨优势，还能在每个像素点上生成完整的衰减函数，适用于活细胞成像、FRET（荧光共振能量转移）分析以及纳米材料表征等前沿应用。
本文将系统梳理TCSPC与TCSPC FLIM的相关技术术语，从基本原理、硬件组成、数据处理到应用实例入手，为读者构建清晰的知识框架，助力科研工作者在这一快速发展的领域中游刃有余。
TCSPC – 时间相关单光子计数
TCSPC通过检测重复光信号中的单光子，测定光子相对于参考（或激发）脉冲的时间，并建立光子相对于参考脉冲后时间的分布，从而记录重复光信号的时间剖面。其最常用的应用是记录荧光衰减函数。TCSPC具有极高的时间分辨率以及近乎理想的光子效率和灵敏度。另请参见”多维TCSPC”。
多维TCSPC
经典TCSPC技术的扩展。多维TCSPC检测重复光信号中的单光子，并测定光子相对于参考（或激发）脉冲的时间，同时确定光子的一个或多个其他参数。这些参数可以是波长、光子发射的样品内空间位置、样品受激发后的时间，或任何可与光子关联的参数。例如：多波长TCSPC、荧光寿命成像（FLIM）、磷光寿命成像（PLIM）、时间序列FLIM，或这些技术的组合。
多波长TCSPC
一种多维TCSPC技术，其中光子的第二个参数是波长。多波长TCSPC同时为不同波长建立多个（当前bh探测器最多可支持16个）荧光衰减曲线。请注意，多波长TCSPC并非基于波长扫描。所有波长的光子均被同时检测并分配到光子分布的不同衰减曲线中。
FLIM – 参见TCSPC FLIM
TCSPC FLIM – 基于TCSPC的荧光寿命成像
TCSPC FLIM使用高频脉冲激光束扫描样品，检测荧光中的单光子，并建立光子相对于激发脉冲后时间及扫描区域坐标的光子分布。请注意，这不是逐像素处理过程。当检测到一个光子时，仅将其放置在对应光子检测时刻激光束位置的像素中，以及对应光子处于激发脉冲周期内时间的相应时间通道中。因此，TCSPC FLIM可在任何扫描速率下工作。FLIM是多维TCSPC最常用的应用。TCSPC FLIM生成一个像素阵列，每个像素包含由大量时间通道组成的荧光衰减曲线。该技术具有极高的时间分辨率和近乎理想的光子效率。通过重复扫描，结果的信噪比仅取决于光子速率和总采集时间。FLIM可作为显微镜中的对比度技术使用，但大多数FLIM应用旨在通过分子参数对荧光衰减函数的影响来确定这些参数，即分子成像。TCSPC FLIM由bh公司于1996年首次推出，最初应用于荧光寿命成像眼底镜（FLIO），随后于1999年扩展到激光扫描显微镜应用。
扫描
TCSPC FLIM使用扫描。尽管扫描使光学系统比宽场系统更复杂，但它具有一大优势：由于每次仅激发单个像素，因此没有来自其他像素的散射光。因此，仅凭扫描（即使没有共焦检测或多光子激发的辅助）就能获得比宽场成像好得多的图像对比度。
FLIO – 荧光寿命成像眼底镜
人眼的临床FLIM技术。视网膜的荧光寿命图像可显示代谢变化的早期迹象，因此可用于在眼部疾病造成永久性损伤前发现其早期阶段。
共焦FLIM
使用共焦系统扫描样品的TCSPC FLIM技术。样品通过物镜用聚焦激光束扫描，荧光光子由物镜收集并投射到与样品共轭平面的针孔中。通过针孔的光子由TCSPC FLIM记录。共焦检测抑制了离焦信号和散射光，从而获得焦平面的清晰寿命图像。
多光子FLIM
样品通过物镜用近红外飞秒激光束扫描，通过多光子（通常为双光子）过程激发。激发仅发生在焦平面，因此无需针孔来抑制离焦荧光。物镜收集的光子直接（无需针孔）传输至FLIM探测器，此原理称为”非退扫描检测”（NDD）。寿命图像的构建通过常规TCSPC FLIM过程完成。多光子成像的优势在于近红外光可深入样品深层，且NDD光路即使光子在离开样品途中发生散射也能将其传输至探测器。因此，多光子FLIM可提供深层样品平面的清晰图像。
IRF – 仪器响应函数
IRF是TCSPC系统在没有样品的情况下直接观测激发激光束时所记录的时间剖面。IRF包括激光脉冲的时间宽度、探测器中的渡越时间分散、可能的同步抖动以及TCSPC模块自身的定时抖动。目前，bh TCSPC设备使用快速混合探测器时IRF宽度（半高全宽）可达18 ps，使用快速SPADs时可达9 ps，使用快速超导单光子探测器（SSPDs）时可达4.4 ps。
电学IRF
电学IRF是TCSPC设备在其输入（探测器和同步）端施加定义好的电脉冲时所记录的时间剖面。电学IRF仅包含TCSPC模块内的定时抖动。bh TCSPC模块的电学IRF宽度（半高全宽）在 <3 ps 至约6 ps之间。
IRF宽度
TCSPC系统IRF宽度的定义有多种。可以是整个TCSPC系统（包括激光器、探测器、TCSPC设备）的IRF宽度，或仅TCSPC设备的IRF宽度。前者为系统IRF，后者为电学IRF。其次，IRF宽度有两种定义。正确的方式是IRF宽度应以”FWHM”（半高全宽）给出。然而，为标称更低的IRF宽度，制造商越来越多地倾向于以”RMS”（均方根）给出IRF宽度。该值并非IRF宽度，而是检测光子的平均定时抖动。RMS定时抖动比IRF的FWHM小2至3倍。
时间分辨率
没有哪个参数比TCSPC的”时间分辨率”定义更模糊。它可以是电学IRF宽度的FWHM、系统IRF的FWHM、电学IRF或系统IRF的RMS定时抖动。为了在时间分辨率上竞争，制造商甚至将时间通道宽度标为”时间分辨率”。时间通道宽度并不能说明真实的时间分辨率，纯粹出于竞争原因被指定为”时间分辨率”。最后，”时间分辨率”可以是系统通过解卷积所能分辨的最小荧光衰减时间。这种分辨率多少是假设性的，不应用于寿命检测系统的比较。
时间通道宽度
时间通道宽度是收集光子的时间通道的宽度。该参数常被错误地标为”时间分辨率”。时间通道宽度必须足够小以正确分辨信号的时间形状，但通常没有必要将其降低到小于系统IRF FWHM的约1/10或信号中最快衰减组分寿命的约1/10。bh TCSPC模块的时间通道宽度低至200飞秒，这足以有效分辨甚至使用快速SSPDs检测的信号。
定时稳定性
随时间变化的定时稳定性对于获得TCSPC和TCSPC FLIM实验的可重复结果非常重要。对于需要长时间采集的弱信号记录也同样重要。bh TCSPC设备具有亚皮秒量级的定时稳定性，且只有bh公司为其TCSPC和TCSPC FLIM设备明确规定了定时稳定性指标。
死时间
死时间是TCSPC设备处理一个光子所需的时间。如果在此时间内检测到另一个光子，则会被忽略。死时间会导致强度尺度的非线性，但不一定会导致记录的荧光衰减剖面出现误差。
计数损失
在记录光子之后的死时间（信号处理时间）段内的光子损失。计数损失会导致TCSPC和TCSPC FLIM的强度尺度非线性，但不会导致记录的衰减剖面出现误差。
饱和计数率
除非计数率受读出速度限制，否则饱和计数率是死时间的倒数。它是TCSPC设备在输入光子速率无限高时所能达到的计数率。TCSPC设备可合理运行至饱和计数率的约50%。
堆积效应
堆积效应发生在TCSPC系统的探测器在同一信号周期内检测到第二个光子而前一个光子已被记录时。第二个光子会丢失。与计数损失不同，堆积效应会导致记录的衰减剖面畸变。该效应随计数率与脉冲重复率比值的增加而增大。堆积效应在早期使用闪光灯激发的TCSPC实验中是一个真正的问题。如今使用高重复率激光光源后，这很少成为问题。关于堆积效应大小存在一个常见的误解：它比通常认为的小100倍。常被引用的”堆积极限”（激发脉冲速率的0.1%）是错误的。实际的堆积极限在光子速率达到激发脉冲速率的10%时。对堆积效应大小的错误估计导致了许多不必要且往往低效的技术尝试，以开发无堆积的荧光寿命检测原理。
暗计数率
暗计数率是探测器在其有效区域无光照射时输出的脉冲速率。暗计数源于PMT、HPD或MCP光电阴极的热发射，或SPAD耗尽层内电子-空穴对的热产生。因此，可通过冷却降低暗计数率。在TCSPC和TCSPC FLIM结果中，暗计数会导致记录衰减函数的基线偏移。然而，暗计数引起的偏移通常远小于后脉冲引起的偏移（见下文）。因此，冷却探测器可能并不总能达到预期效果。
后脉冲
后脉冲是探测器在检测到一个光子后的最初几微秒内产生虚假脉冲的倾向。在PMT中，后脉冲由管内真空中的残余气体原子电离引起；在SPAD中，后脉冲来自先前光子载流子雪崩后残留的被捕获载流子。在高重复率TCSPC应用中，来自多个激发周期光子的后脉冲累加形成显著的计数背景。因此，后脉冲背景可能远高于暗计数背景。后脉冲无法通过冷却减少。避免后脉冲的最佳方法是使用混合探测器。混合光电探测器（HPDs、HPMs）无后脉冲，因为每个光子仅有一个电子在真空中运动。
信噪比（SNR）
当记录光信号时，信噪比受限于记录光子数的平方根。该规则既适用于记录的强度，也适用于记录的荧光寿命。提高信噪比的唯一方法是记录更多光子，可通过增加采集时间、提高探测器输入光子速率或使用具有更高探测量子效率的探测器实现。在FLIM中，可通过减少像素数量来提高各像素寿命的信噪比。对于给定的光子速率和采集时间，每个像素的光子数将按比例增加。然而，减少像素数以牺牲空间分辨率为代价。通常在FLIM数据分析中通过重叠合并获得更好的结果。
探测效率
探测效率是光子被TCSPC系统检测（和记录）的效率。”探测效率”一词在不同语境中使用。它可以是一个光子到达探测器光学输入端时在其输出端产生有用电脉冲的概率、光子被TCSPC设备记录的概率，或样品发射的光子被记录的概率。在最后一种情况下，”探测效率”包括光子被光学系统收集、通过滤光片和透镜及反射镜系统或光纤、并投射到探测器有效区域上的概率。在FLIM中，光学系统的效率尤其重要。光子是各向同性发射的，因此效率随物镜数值孔径的平方而增加。
光子效率
光子效率描述了寿命检测技术需要检测多少光子才能达到给定的信噪比。其定义为理论上达到该信噪比所需的光子数除以实际所需的光子数。当测量条件选择正确时，TCSPC和TCSPC FLIM的光子效率为1。如果系统IRF过长、信号被后脉冲或暗计数背景污染，以及荧光衰减未完全处于记录时间间隔内，光子效率会降低。
采集时间
没有哪个参数比TCSPC和TCSPC FLIM的采集时间更具争议性。在早期TCSPC系统中，激发脉冲速率约为10 kHz。因此，有用光子速率受堆积效应限制，采集时间极长。现在，通过重复率在50至80 MHz范围内的激发光源，堆积问题已得到克服。因此，采集时间取决于对结果信噪比的期望、可从样品获得的光子速率、探测效率以及在FLIM中像素数量和寿命分析中的合并因子。根据所需的信噪比，当今的TCSPC设备可在毫秒到数十秒内记录荧光衰减曲线，FLIM可在不到一秒到几分钟内完成。一个普遍的误解是”更快”的TCSPC模块（死时间更短）可减少采集时间。然而，除非TCSPC输入端的脉冲速率能够或可以被提高到高于死时间的倒数，否则情况并非如此。特别是对于生物样品，从样品可获得的光子计数率是有限的，且不会高于普通TCSPC/FLIM模块所能处理的计数率。
DNL – 微分非线性
DNL是TCSPC/FLIM模块中时间转换的时间通道宽度的均匀性。不均匀的时间通道宽度会导致后续时间通道中光子数的不均匀分布。因此，DNL会在记录的信号形状中引入噪声。DNL是早期TCSPC设备的一个问题，但已通过bh公司于1993年推出的新型TAC/ADC原理在很大程度上得到克服。实际上，DNL误差更可能由光子脉冲与同步信号之间的电串扰引起，而非来自TCSPC模块内部的DNL。
通道非均匀性 – 参见DNL
抖动
一种提高TAC-ADC组合DNL（超越ADC本身DNL）的方法。TAC的输出信号从一个光子到另一个光子被轻微偏移，使得时间测量发生在ADC特性的不同位置。随后该偏移从ADC信号中数字减除以避免电学IRF展宽。该方法由bh公司于1993年引入，是bh快速TAC-ADC定时原理的基础。
CFD – 恒比甄别器
来自大多数单光子探测器的光子脉冲具有相当大的幅度抖动。必须避免幅度抖动在TCSPC设备的甄别器中引起定时抖动。因此，TCSPC使用”恒比甄别器”，即当脉冲达到其全幅度的给定比例时触发甄别器。技术上，这是通过将光子脉冲重塑为双极性形状实现的。过零点的位置与脉冲幅度无关。通过在过零点触发，幅度引起的定时抖动在很大程度上得以避免。
TAC – 时间幅度转换器
TAC将起始脉冲和停止脉冲之间的时间差转换为电脉冲的幅度。然后该幅度通过模数转换器（ADC）转换为数字起始-停止时间。数字起始-停止时间确定当前光子被添加的时间通道。TAC-ADC原理是TCSPC中最古老的时间转换原理。bh公司已在其转换速度和时间分辨率方面进行了升级，目前它是具有最高时间分辨率的原理。基于TAC-ADC原理的bh TCSPC模块可实现小于2 ps的电学IRF宽度和小于1 ps的RMS定时抖动。时间通道宽度可选小至200飞秒。没有其他TCSPC模块能达到接近此分辨率的性能。
TDC – 时间数字转换器
TDC通过将事件（在TCSPC中通常是光子的检测）发送通过逻辑门链来测量其时间。通过将光子脉冲发送通过一个延迟链，将同步脉冲发送通过另一个延迟链，可以确定光子与同步脉冲之间的时间。电学IRF宽度通常为40 ps至80 ps，最小时间通道宽度为几皮秒。TDC原理的一个优势是可以在一个TCSPC板上轻松制作多个定时通道。该原理用于bh SPC-QC-104模块。
并行计数器通道
近期bh TCSPC FLIM模块在定时电路旁设有并行计数器通道。该计数器几乎无死时间地计数光子。通过从定时电路获取光子时间，从并行计数器获取光子数，可获得具有线性强度尺度的FLIM图像。
PMT – 光电倍增管
PMT是具有光电阴极和多个放大级（倍增极）的光子计数探测器。光电子从光电阴极加速到第一倍增极，在倍增极上产生多个二次电子，这些二次电子加速到下一个倍增极并产生更多电子。PMT具有五到九个倍增极，倍增因子可达10⁷。因此，单个光子可产生几mA的可检测输出脉冲。
HPD – 混合光电探测器
光电子在光电阴极产生并加速射向硅雪崩二极管。当光电子撞击二极管时，产生数千个电子-空穴对，这些载流子通过二极管中的雪崩过程进一步放大。总增益约为10⁶，意味着单个光子可在探测器输出端产生可检测脉冲。混合探测器具有极低的渡越时间分散（定时抖动）且无后脉冲。bh HPM-100系列混合探测器基于滨松的HPDs。
SPAD – 单光子雪崩光电二极管
SPAD是一种反向电压增加到击穿电平以上的光电二极管。当检测到光子时，它会引起二极管中的雪崩击穿，产生一个易于检测的输出脉冲。每次击穿后，电子”淬灭电路”恢复正常操作。SPADs具有高量子效率、小的渡越时间分散，但只有小的有效面积。此外，它们并非无后脉冲。
SSPD – 超导单光子探测器
SSPD由超导材料的微观微结构组成。为实现超导，整个结构被冷却至低于3开尔文。微小电流通过该结构。当光子击中结构时，超导性短暂破坏，产生电脉冲。SSPDs具有极短的渡越时间分散和高达红外波长的高量子效率。缺点是有效面积小且需要极低温冷却。
TTS – 渡越时间分散
TTS是探测器的内部定时抖动。PMT的TTS在亚纳秒范围，HPDs和快速SPADs在10至20 ps范围，SSPDs在几皮秒范围。在PMTs和HPDs中，光电阴极的电子发射可贡献于TTS。传统双碱和多碱光电阴极的发射是瞬时的，但半导体阴极（InGaAs、GaAs）的发射存在随机延迟。这些阴极的光电子发射可贡献约100至200 ps给探测器的TTS。
SER – 单电子响应
SER是探测器对单个光电子产生的电脉冲形状。它非常类似于单个光子的输出脉冲。SER通常比TTS宽得多。这就是为什么TCSPC能提供比使用相同探测器作为模拟电光设备的技术高得多的时间分辨率的原因。例如，混合探测器的SER宽约800 ps，但TCSPC IRF可短至18 ps。
QE – 探测量子效率
探测器的QE（量子效率）是光子引起可检测输出脉冲的概率。PMTs产生随机幅度的脉冲，因此有效QE取决于后续甄别器的阈值。因此，PMTs的QE定义有时被”阴极光照灵敏度”取代，即每瓦入射光功率的阴极电流（mA）。请参阅bh TCSPC手册。
激发态寿命
激发态寿命是受激分子从其激发到返回基态所需的平均时间。
荧光寿命
就S1态而言，荧光寿命与激发态寿命相同。
荧光衰减函数
大量光子和/或大量激发/发射周期所发射荧光信号的平均时间剖面。对于均匀环境中均匀分子集合，荧光衰减函数是单指数的。荧光寿命是从激发脉冲到衰减函数1/e点的时间。
多指数衰减
实际上，荧光衰减函数很少是单指数的。偏离单指数衰减是由于分子环境的不均匀性、荧光分子（荧光团）与蛋白质、酶和脂质结合的不均匀性、荧光团自身构象的不均匀性，或仅仅是不同荧光分子的存在引起的。多指数衰减由具有不同寿命和幅度的多个衰减组分描述。多指数衰减曲线的构成包含与荧光团关联的系统的分子信息。解析多指数衰减函数是将TCSPC和TCSPC FLIM用作分子成像技术的关键。
三十余载TCSPC与TCSPC FLIM技术积淀——作为行业技术领导者，Becker & Hickl始终致力于提供具有卓越时间分辨率的TCSPC设备与时间标记器。其SPC系列模块可广泛应用于经典及多维荧光衰减测量、荧光寿命成像（FLIM）、多波长FLIM、荧光/磷光寿命同步成像（FLIM/PLIM）、快速时间序列FLIM、荧光相关光谱（FCS）、单分子实验、反聚束实验（HBT）、量子应用等诸多多维光子记录领域。
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