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Argolight荧光显微成像校准工具

Argolight荧光显微成像校准工具插图

Argolight荧光显微成像校准工具插图1        Argolight是一家法国的公司,专注于成像质量的控制,公司最初是为了解决NASA提出的请求,帮助他们保障国际空间站上的显微镜的准确性和可靠性,以达到验证显微镜质量且可以重复实验结果的目的。经过几年的努力,多代产品的更新,最终得到了NASA的认可,也亲眼见证了Argolight的产品搭乘着SpaceX的火箭,同宇航员一同进入了国际空间站。

现在全球已经有300多个客户在使用我们的产品,我们正在与他们一起应对成像质量和可重复性问题。

Argolight荧光显微成像校准工具插图2Argolight荧光显微成像校准工具插图3        Argolight的产品满足ISO 21073:2019 标准,该标准旨在用于评估共焦激光扫描显微镜图像性能的指标,用于荧光生物标本成像领域。并且积极与NIST合作,旨在为成像质量评估出一个标准。

我们的产品包含稳定的荧光图案,具有精确定义的特征。图案可以用250nm到650nm之间的任何波长激发。发射光谱是一个宽的连续谱,从略高于激发波长开始,一直到800 nm。

一个产品包含几个荧光图案。每个图案都旨在评估显微镜的一个或多个参数:分辨率、场均匀性、强度响应、通道之间的配准精度等。Argolight的荧光图案是一种无机荧光物质,可以重复使用长达数年之久,并且对于贮存条件没有要求。Daybook软件也供免费使用,即便您不购买Argolight的软件,Daybook依然可以帮助您进行PSF的测量。

在今年Argolight使用一种改进的玻璃技术,产生两倍的荧光量:AG03,第三代 ArgoGlass®。AG03经过3年的研发,相比AG02具有更高的量子效率。在相同曝光下,这些图案现在比第一代显示出至少 100% 的荧光强度。校准片内荧光的存在仍然是确定的且持久的,荧光图案将永远可见。就此而言,这些校准片现在终身保修。

Argolight荧光显微成像校准工具插图4        接下来我们展示一个具体的Confocal.nl的案例,该案例使用 Argo-SIM 来展示其横向分辨率的优势。

Argolight荧光显微成像校准工具插图5使用 RCM1 技术以 60x 1.4 放大倍率获取的示例图像(2×2 拼接图像)。COS-7 细胞中的微管蛋白丝。  Andreas Kurz,德国维尔茨堡大学

创新:再扫描共聚焦显微镜

        Confocal.nl是一家荷兰制造商,它开发了一种技术用来提高横向分辨率,同时保持标准共聚焦显微镜的切片能力。该公司由Erik Manders和Peter Drent于 2016 年创立。第二代再扫描共聚焦显微镜(RCM)是2021 年推出的一种新的超分辨率显微成像技术,它基于标准共焦显微镜,扩展了一个光学单元(再扫描),可将图像直接投射到 CCD 相机上。为了展示新系统的分辨率,制造商需要用已知尺寸的样品,通常使用荧光微球。然而,Confocal.NL 决定不再使用荧光微球,因为它们“有时难以集中拍摄并随着时间的推移而漂白”。此外,由于它们的尺寸不是无限小,导致扩大了显微镜点扩散函数 (PSF),因此低估了光学系统的分辨率。

Argolight荧光显微成像校准工具插图6Confocal.nl 使用 Argo-SIM 的荧光模式进行分辨率测量。 该图案呈现出成对的 36 μm 长线,其间距逐渐增加,从 0 到 390 nm,步长为 30 nm。存在四组线:一组垂直,一组水平,两组位于 + 和 - 45°

 

参考样本:Argo-SIM校准片

        Confocal 最终决定使用 Argolight 校准片而不是荧光微球或PSF方式。某些型号的 Argolight校准片里面的荧光图案,专用于测量分辨率。该图案的线条由已知的距离隔开,这使得它非常适合测量系统区分物体的能力。Argolight 提供免费的图像分析软件Daybook。Daybook 中使用的方法依赖于对比度传递函数,即测量对比度与逐渐间隔的线之间的距离。

测量分辨率:结果

        Confocal.nl使用带有 100x/1.5 油物镜 (UPLAPO100XOHR) 的 Olympus IX83 显微镜框架,使用其RCM2对Argo-SIM 校准片的荧光图案进行成像。在Argo-SIM 中,图案由成对的36 μm 长的线组成,它们的间距逐渐增加,从0到390 nm,步长为30 nm。该图案由405nm 激光激发,用Tucsen FL20-BW 相机检测。在应用说明:“使用 Argolight Argo-SIM校准片测量的再扫描共聚焦显微镜的横向分辨率”中,Confocal.nl指出:

采集设置样本平面中的像素大小为 16.5nm/像素,显微镜的 z-stepper 设置为 100nm 间隔,总共采用 4μm的 z-stack 以便能够进行适当的反卷积。随后由具有专用 RCM 点扩散函数的 Microvolution 执行反卷积。这些图显示了具有理想焦点的 z 轴切片。随后使用来自 Argolight 的 Daybook 3 软件对数据集进行分析,使用高斯拟合模型和 7.3% 的对比度标准获得结果(对应于在理想成像条件下等于显微镜 PSF 的 FWHM 的对比度值)。

用肉眼看图案图像,在150nm的距离就可以分辨出分辨率。对图像应用去卷积,之后图案的线条可以在120nm处解析。Daybook 中的图像分析使用 7.3% 的对比度标准(高斯拟合),在反卷积之前提供了 178.5nm 的横向分辨率,之后提供了 120nm 的横向分辨率。

Argolight荧光显微成像校准工具插图7

“ Argo-SIM 校准片使我们能够定量和准确地确定 RCM2 的横向分辨率水平,而不会引入用户偏见。” Confocal.nl

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Daybook 中横向分辨率分析的示例结果(Zeiss 宽场 Axio Imager M2,配备 Zeiss Plan-Apochromat 63×/1.4 Oil 物镜,使用 Zeiss Colibri 2 照明,使用 Hamamatsu Orca-Flash 4.0 LT 相机收集) 7.3% 对比度标准(高斯拟合),分辨率为 386nm。

使用 Argo-SIM 校准片及其荧光图案,Confocal.nl 可以准确地确认他们的新系统 RCM2 达到了先前指定的规格并在图像中实现了超分辨率。这种方法提供的结果可以使其他研究人员或客户信任,因为他们的协议记录在案并依赖于 Argolight 的高质量认证标准。Argolight 非常自豪能够为 Confocal.NL 提供工具来展示他们的创新技术。

Argolight拥有数种产品,以满足不同客户的需求:

Argolight荧光显微成像校准工具插图9        如果您对成像质量有要求,或者对自己的成像系统有所怀疑,不要犹豫,立即联系我们产品经理。

产品经理联系方式
电话:13248255905(杨经理)
邮箱:factory-yang@star-spectrum.com
地址:上海市普陀区中江路388弄国盛中心2号楼1506室

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