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TCSPC与TCSPC FLIM技术术语

在现代生物医学成像领域，荧光显微技术已成为揭示细胞和分子动态过程的核心工具。传统基于荧光强度的成像方法虽然直观，但往往受限于荧光染料浓度、光漂白效应以及环境淬灭等因素，导致信号易受干扰，无法精确反映分子微环境的变化。为克服这些局限，荧光寿命成像显微镜（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM）应运而生。它通过测量荧光分子的激发态寿命（荧光寿命），提供了一种独立于浓度的成像对比机制，能够更深入地探究分子相互作用、pH值、氧浓度、黏度等生理参数。

时间相关单光子计数（Time-Correlated Single Photon Counting, TCSPC）技术，正是实现高精度FLIM的核心方法。该技术利用脉冲激光激发样品，借助单光子探测器精确记录每个发射光子相对于激发脉冲的到达时间。通过多次重复激发-发射循环，构建光子到达时间直方图，最终拟合出荧光衰减曲线，实现皮秒级的时间分辨率和近乎理想的光子计数效率。

TCSPC FLIM 将TCSPC与激光扫描显微镜相结合，不仅保留了TCSPC的高灵敏度和时间分辨优势，还能在每个像素点上生成完整的衰减函数，适用于活细胞成像、FRET（荧光共振能量转移）分析以及纳米材料表征等前沿应用。

本文将系统梳理TCSPC与TCSPC FLIM的相关技术术语，从基本原理、硬件组成、数据处理到应用实例入手，为读者构建清晰的知识框架，助力科研工作者在这一快速发展的领域中游刃有余。

TCSPC – 时间相关单光子计数
TCSPC通过检测重复光信号中的单光子，测定光子相对于参考（或激发）脉冲的时间，并建立光子相对于参考脉冲后时间的分布，从而记录重复光信号的时间剖面。其最常用的应用是记录荧光衰减函数。TCSPC具有极高的时间分辨率以及近乎理想的光子效率和灵敏度。另请参见”多维TCSPC”。

多维TCSPC
经典TCSPC技术的扩展。多维TCSPC检测重复光信号中的单光子，并测定光子相对于参考（或激发）脉冲的时间，同时确定光子的一个或多个其他参数。这些参数可以是波长、光子发射的样品内空间位置、样品受激发后的时间，或任何可与光子关联的参数。例如：多波长TCSPC、荧光寿命成像（FLIM）、磷光寿命成像（PLIM）、时间序列FLIM，或这些技术的组合。

多波长TCSPC
一种多维TCSPC技术，其中光子的第二个参数是波长。多波长TCSPC同时为不同波长建立多个（当前bh探测器最多可支持16个）荧光衰减曲线。请注意，多波长TCSPC并非基于波长扫描。所有波长的光子均被同时检测并分配到光子分布的不同衰减曲线中。

FLIM – 参见TCSPC FLIM

TCSPC FLIM – 基于TCSPC的荧光寿命成像
TCSPC FLIM使用高频脉冲激光束扫描样品，检测荧光中的单光子，并建立光子相对于激发脉冲后时间及扫描区域坐标的光子分布。请注意，这不是逐像素处理过程。当检测到一个光子时，仅将其放置在对应光子检测时刻激光束位置的像素中，以及对应光子处于激发脉冲周期内时间的相应时间通道中。因此，TCSPC FLIM可在任何扫描速率下工作。FLIM是多维TCSPC最常用的应用。TCSPC FLIM生成一个像素阵列，每个像素包含由大量时间通道组成的荧光衰减曲线。该技术具有极高的时间分辨率和近乎理想的光子效率。通过重复扫描，结果的信噪比仅取决于光子速率和总采集时间。FLIM可作为显微镜中的对比度技术使用，但大多数FLIM应用旨在通过分子参数对荧光衰减函数的影响来确定这些参数，即分子成像。TCSPC FLIM由bh公司于1996年首次推出，最初应用于荧光寿命成像眼底镜（FLIO），随后于1999年扩展到激光扫描显微镜应用。

扫描
TCSPC FLIM使用扫描。尽管扫描使光学系统比宽场系统更复杂，但它具有一大优势：由于每次仅激发单个像素，因此没有来自其他像素的散射光。因此，仅凭扫描（即使没有共焦检测或多光子激发的辅助）就能获得比宽场成像好得多的图像对比度。

FLIO – 荧光寿命成像眼底镜
人眼的临床FLIM技术。视网膜的荧光寿命图像可显示代谢变化的早期迹象，因此可用于在眼部疾病造成永久性损伤前发现其早期阶段。

共焦FLIM
使用共焦系统扫描样品的TCSPC FLIM技术。样品通过物镜用聚焦激光束扫描，荧光光子由物镜收集并投射到与样品共轭平面的针孔中。通过针孔的光子由TCSPC FLIM记录。共焦检测抑制了离焦信号和散射光，从而获得焦平面的清晰寿命图像。

多光子FLIM
样品通过物镜用近红外飞秒激光束扫描，通过多光子（通常为双光子）过程激发。激发仅发生在焦平面，因此无需针孔来抑制离焦荧光。物镜收集的光子直接（无需针孔）传输至FLIM探测器，此原理称为”非退扫描检测”（NDD）。寿命图像的构建通过常规TCSPC FLIM过程完成。多光子成像的优势在于近红外光可深入样品深层，且NDD光路即使光子在离开样品途中发生散射也能将其传输至探测器。因此，多光子FLIM可提供深层样品平面的清晰图像。

IRF – 仪器响应函数
IRF是TCSPC系统在没有样品的情况下直接观测激发激光束时所记录的时间剖面。IRF包括激光脉冲的时间宽度、探测器中的渡越时间分散、可能的同步抖动以及TCSPC模块自身的定时抖动。目前，bh TCSPC设备使用快速混合探测器时IRF宽度（半高全宽）可达18 ps，使用快速SPADs时可达9 ps，使用快速超导单光子探测器（SSPDs）时可达4.4 ps。

电学IRF
电学IRF是TCSPC设备在其输入（探测器和同步）端施加定义好的电脉冲时所记录的时间剖面。电学IRF仅包含TCSPC模块内的定时抖动。bh TCSPC模块的电学IRF宽度（半高全宽）在 <3 ps 至约6 ps之间。

IRF宽度
TCSPC系统IRF宽度的定义有多种。可以是整个TCSPC系统（包括激光器、探测器、TCSPC设备）的IRF宽度，或仅TCSPC设备的IRF宽度。前者为系统IRF，后者为电学IRF。其次，IRF宽度有两种定义。正确的方式是IRF宽度应以”FWHM”（半高全宽）给出。然而，为标称更低的IRF宽度，制造商越来越多地倾向于以”RMS”（均方根）给出IRF宽度。该值并非IRF宽度，而是检测光子的平均定时抖动。RMS定时抖动比IRF的FWHM小2至3倍。

时间分辨率
没有哪个参数比TCSPC的”时间分辨率”定义更模糊。它可以是电学IRF宽度的FWHM、系统IRF的FWHM、电学IRF或系统IRF的RMS定时抖动。为了在时间分辨率上竞争，制造商甚至将时间通道宽度标为”时间分辨率”。时间通道宽度并不能说明真实的时间分辨率，纯粹出于竞争原因被指定为”时间分辨率”。最后，”时间分辨率”可以是系统通过解卷积所能分辨的最小荧光衰减时间。这种分辨率多少是假设性的，不应用于寿命检测系统的比较。

时间通道宽度
时间通道宽度是收集光子的时间通道的宽度。该参数常被错误地标为”时间分辨率”。时间通道宽度必须足够小以正确分辨信号的时间形状，但通常没有必要将其降低到小于系统IRF FWHM的约1/10或信号中最快衰减组分寿命的约1/10。bh TCSPC模块的时间通道宽度低至200飞秒，这足以有效分辨甚至使用快速SSPDs检测的信号。

定时稳定性
随时间变化的定时稳定性对于获得TCSPC和TCSPC FLIM实验的可重复结果非常重要。对于需要长时间采集的弱信号记录也同样重要。bh TCSPC设备具有亚皮秒量级的定时稳定性，且只有bh公司为其TCSPC和TCSPC FLIM设备明确规定了定时稳定性指标。

死时间
死时间是TCSPC设备处理一个光子所需的时间。如果在此时间内检测到另一个光子，则会被忽略。死时间会导致强度尺度的非线性，但不一定会导致记录的荧光衰减剖面出现误差。

计数损失
在记录光子之后的死时间（信号处理时间）段内的光子损失。计数损失会导致TCSPC和TCSPC FLIM的强度尺度非线性，但不会导致记录的衰减剖面出现误差。

饱和计数率
除非计数率受读出速度限制，否则饱和计数率是死时间的倒数。它是TCSPC设备在输入光子速率无限高时所能达到的计数率。TCSPC设备可合理运行至饱和计数率的约50%。

堆积效应
堆积效应发生在TCSPC系统的探测器在同一信号周期内检测到第二个光子而前一个光子已被记录时。第二个光子会丢失。与计数损失不同，堆积效应会导致记录的衰减剖面畸变。该效应随计数率与脉冲重复率比值的增加而增大。堆积效应在早期使用闪光灯激发的TCSPC实验中是一个真正的问题。如今使用高重复率激光光源后，这很少成为问题。关于堆积效应大小存在一个常见的误解：它比通常认为的小100倍。常被引用的”堆积极限”（激发脉冲速率的0.1%）是错误的。实际的堆积极限在光子速率达到激发脉冲速率的10%时。对堆积效应大小的错误估计导致了许多不必要且往往低效的技术尝试，以开发无堆积的荧光寿命检测原理。

暗计数率
暗计数率是探测器在其有效区域无光照射时输出的脉冲速率。暗计数源于PMT、HPD或MCP光电阴极的热发射，或SPAD耗尽层内电子-空穴对的热产生。因此，可通过冷却降低暗计数率。在TCSPC和TCSPC FLIM结果中，暗计数会导致记录衰减函数的基线偏移。然而，暗计数引起的偏移通常远小于后脉冲引起的偏移（见下文）。因此，冷却探测器可能并不总能达到预期效果。

后脉冲
后脉冲是探测器在检测到一个光子后的最初几微秒内产生虚假脉冲的倾向。在PMT中，后脉冲由管内真空中的残余气体原子电离引起；在SPAD中，后脉冲来自先前光子载流子雪崩后残留的被捕获载流子。在高重复率TCSPC应用中，来自多个激发周期光子的后脉冲累加形成显著的计数背景。因此，后脉冲背景可能远高于暗计数背景。后脉冲无法通过冷却减少。避免后脉冲的最佳方法是使用混合探测器。混合光电探测器（HPDs、HPMs）无后脉冲，因为每个光子仅有一个电子在真空中运动。

信噪比（SNR）
当记录光信号时，信噪比受限于记录光子数的平方根。该规则既适用于记录的强度，也适用于记录的荧光寿命。提高信噪比的唯一方法是记录更多光子，可通过增加采集时间、提高探测器输入光子速率或使用具有更高探测量子效率的探测器实现。在FLIM中，可通过减少像素数量来提高各像素寿命的信噪比。对于给定的光子速率和采集时间，每个像素的光子数将按比例增加。然而，减少像素数以牺牲空间分辨率为代价。通常在FLIM数据分析中通过重叠合并获得更好的结果。

探测效率
探测效率是光子被TCSPC系统检测（和记录）的效率。”探测效率”一词在不同语境中使用。它可以是一个光子到达探测器光学输入端时在其输出端产生有用电脉冲的概率、光子被TCSPC设备记录的概率，或样品发射的光子被记录的概率。在最后一种情况下，”探测效率”包括光子被光学系统收集、通过滤光片和透镜及反射镜系统或光纤、并投射到探测器有效区域上的概率。在FLIM中，光学系统的效率尤其重要。光子是各向同性发射的，因此效率随物镜数值孔径的平方而增加。

光子效率
光子效率描述了寿命检测技术需要检测多少光子才能达到给定的信噪比。其定义为理论上达到该信噪比所需的光子数除以实际所需的光子数。当测量条件选择正确时，TCSPC和TCSPC FLIM的光子效率为1。如果系统IRF过长、信号被后脉冲或暗计数背景污染，以及荧光衰减未完全处于记录时间间隔内，光子效率会降低。

采集时间
没有哪个参数比TCSPC和TCSPC FLIM的采集时间更具争议性。在早期TCSPC系统中，激发脉冲速率约为10 kHz。因此，有用光子速率受堆积效应限制，采集时间极长。现在，通过重复率在50至80 MHz范围内的激发光源，堆积问题已得到克服。因此，采集时间取决于对结果信噪比的期望、可从样品获得的光子速率、探测效率以及在FLIM中像素数量和寿命分析中的合并因子。根据所需的信噪比，当今的TCSPC设备可在毫秒到数十秒内记录荧光衰减曲线，FLIM可在不到一秒到几分钟内完成。一个普遍的误解是”更快”的TCSPC模块（死时间更短）可减少采集时间。然而，除非TCSPC输入端的脉冲速率能够或可以被提高到高于死时间的倒数，否则情况并非如此。特别是对于生物样品，从样品可获得的光子计数率是有限的，且不会高于普通TCSPC/FLIM模块所能处理的计数率。

DNL – 微分非线性
DNL是TCSPC/FLIM模块中时间转换的时间通道宽度的均匀性。不均匀的时间通道宽度会导致后续时间通道中光子数的不均匀分布。因此，DNL会在记录的信号形状中引入噪声。DNL是早期TCSPC设备的一个问题，但已通过bh公司于1993年推出的新型TAC/ADC原理在很大程度上得到克服。实际上，DNL误差更可能由光子脉冲与同步信号之间的电串扰引起，而非来自TCSPC模块内部的DNL。

通道非均匀性 – 参见DNL

抖动
一种提高TAC-ADC组合DNL（超越ADC本身DNL）的方法。TAC的输出信号从一个光子到另一个光子被轻微偏移，使得时间测量发生在ADC特性的不同位置。随后该偏移从ADC信号中数字减除以避免电学IRF展宽。该方法由bh公司于1993年引入，是bh快速TAC-ADC定时原理的基础。

CFD – 恒比甄别器
来自大多数单光子探测器的光子脉冲具有相当大的幅度抖动。必须避免幅度抖动在TCSPC设备的甄别器中引起定时抖动。因此，TCSPC使用”恒比甄别器”，即当脉冲达到其全幅度的给定比例时触发甄别器。技术上，这是通过将光子脉冲重塑为双极性形状实现的。过零点的位置与脉冲幅度无关。通过在过零点触发，幅度引起的定时抖动在很大程度上得以避免。

TAC – 时间幅度转换器
TAC将起始脉冲和停止脉冲之间的时间差转换为电脉冲的幅度。然后该幅度通过模数转换器（ADC）转换为数字起始-停止时间。数字起始-停止时间确定当前光子被添加的时间通道。TAC-ADC原理是TCSPC中最古老的时间转换原理。bh公司已在其转换速度和时间分辨率方面进行了升级，目前它是具有最高时间分辨率的原理。基于TAC-ADC原理的bh TCSPC模块可实现小于2 ps的电学IRF宽度和小于1 ps的RMS定时抖动。时间通道宽度可选小至200飞秒。没有其他TCSPC模块能达到接近此分辨率的性能。

TDC – 时间数字转换器
TDC通过将事件（在TCSPC中通常是光子的检测）发送通过逻辑门链来测量其时间。通过将光子脉冲发送通过一个延迟链，将同步脉冲发送通过另一个延迟链，可以确定光子与同步脉冲之间的时间。电学IRF宽度通常为40 ps至80 ps，最小时间通道宽度为几皮秒。TDC原理的一个优势是可以在一个TCSPC板上轻松制作多个定时通道。该原理用于bh SPC-QC-104模块。

并行计数器通道
近期bh TCSPC FLIM模块在定时电路旁设有并行计数器通道。该计数器几乎无死时间地计数光子。通过从定时电路获取光子时间，从并行计数器获取光子数，可获得具有线性强度尺度的FLIM图像。

PMT – 光电倍增管
PMT是具有光电阴极和多个放大级（倍增极）的光子计数探测器。光电子从光电阴极加速到第一倍增极，在倍增极上产生多个二次电子，这些二次电子加速到下一个倍增极并产生更多电子。PMT具有五到九个倍增极，倍增因子可达10⁷。因此，单个光子可产生几mA的可检测输出脉冲。

HPD – 混合光电探测器
光电子在光电阴极产生并加速射向硅雪崩二极管。当光电子撞击二极管时，产生数千个电子-空穴对，这些载流子通过二极管中的雪崩过程进一步放大。总增益约为10⁶，意味着单个光子可在探测器输出端产生可检测脉冲。混合探测器具有极低的渡越时间分散（定时抖动）且无后脉冲。bh HPM-100系列混合探测器基于滨松的HPDs。

SPAD – 单光子雪崩光电二极管
SPAD是一种反向电压增加到击穿电平以上的光电二极管。当检测到光子时，它会引起二极管中的雪崩击穿，产生一个易于检测的输出脉冲。每次击穿后，电子”淬灭电路”恢复正常操作。SPADs具有高量子效率、小的渡越时间分散，但只有小的有效面积。此外，它们并非无后脉冲。

SSPD – 超导单光子探测器
SSPD由超导材料的微观微结构组成。为实现超导，整个结构被冷却至低于3开尔文。微小电流通过该结构。当光子击中结构时，超导性短暂破坏，产生电脉冲。SSPDs具有极短的渡越时间分散和高达红外波长的高量子效率。缺点是有效面积小且需要极低温冷却。

TTS – 渡越时间分散
TTS是探测器的内部定时抖动。PMT的TTS在亚纳秒范围，HPDs和快速SPADs在10至20 ps范围，SSPDs在几皮秒范围。在PMTs和HPDs中，光电阴极的电子发射可贡献于TTS。传统双碱和多碱光电阴极的发射是瞬时的，但半导体阴极（InGaAs、GaAs）的发射存在随机延迟。这些阴极的光电子发射可贡献约100至200 ps给探测器的TTS。

SER – 单电子响应
SER是探测器对单个光电子产生的电脉冲形状。它非常类似于单个光子的输出脉冲。SER通常比TTS宽得多。这就是为什么TCSPC能提供比使用相同探测器作为模拟电光设备的技术高得多的时间分辨率的原因。例如，混合探测器的SER宽约800 ps，但TCSPC IRF可短至18 ps。

QE – 探测量子效率
探测器的QE（量子效率）是光子引起可检测输出脉冲的概率。PMTs产生随机幅度的脉冲，因此有效QE取决于后续甄别器的阈值。因此，PMTs的QE定义有时被”阴极光照灵敏度”取代，即每瓦入射光功率的阴极电流（mA）。请参阅bh TCSPC手册。

激发态寿命
激发态寿命是受激分子从其激发到返回基态所需的平均时间。

荧光寿命
就S1态而言，荧光寿命与激发态寿命相同。

荧光衰减函数
大量光子和/或大量激发/发射周期所发射荧光信号的平均时间剖面。对于均匀环境中均匀分子集合，荧光衰减函数是单指数的。荧光寿命是从激发脉冲到衰减函数1/e点的时间。

多指数衰减
实际上，荧光衰减函数很少是单指数的。偏离单指数衰减是由于分子环境的不均匀性、荧光分子（荧光团）与蛋白质、酶和脂质结合的不均匀性、荧光团自身构象的不均匀性，或仅仅是不同荧光分子的存在引起的。多指数衰减由具有不同寿命和幅度的多个衰减组分描述。多指数衰减曲线的构成包含与荧光团关联的系统的分子信息。解析多指数衰减函数是将TCSPC和TCSPC FLIM用作分子成像技术的关键。

三十余载TCSPC与TCSPC FLIM技术积淀——作为行业技术领导者，Becker & Hickl始终致力于提供具有卓越时间分辨率的TCSPC设备与时间标记器。其SPC系列模块可广泛应用于经典及多维荧光衰减测量、荧光寿命成像（FLIM）、多波长FLIM、荧光/磷光寿命同步成像（FLIM/PLIM）、快速时间序列FLIM、荧光相关光谱（FCS）、单分子实验、反聚束实验（HBT）、量子应用等诸多多维光子记录领域。

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用于量子研究的激光器

用于量子研究的激光器插图

作为第二次量子革命的重要组成部分，全球研究人员与企业正竞相寻找适用于下一代应用的理想量子系统——这些应用涵盖量子传感与通信、量子模拟乃至量子比特计算等多个领域。这一蓬勃发展的领域正推动着具有高度特异性功能的新材料发现，以满足多样化的技术需求。

HÜBNER Photonics很自豪能通过专为量子研究打造的新一代光子产品系列，为这一发展浪潮贡献力量。我们的解决方案以精密性、稳定性和多功能性为核心设计理念，助力科学家不断突破量子技术的可能性边界。

C-WAVE系列

C-WAVE可调谐激光器是一种广泛可调的连续波激光光源，其覆盖的可见光及近红外波长范围达到了前所未有的广度。该系列产品可为您的应用提供450至1500nm以及1700至3400nm的波长覆盖，输出功率达到瓦级别，且完全自动化运行，无需人工校准。

  • 波长覆盖范围从 450 nm到 3500 nm
  • 在可见光范围内高达 250 nm（500-750nm) 的无缝隙调谐范围 
  • 单频工作，典型线宽小于 500 kHz
  • 特别适用于表征新型色心的光致发光特性

隆重推出 C-WAVE BTS——C-WAVE 系列的最新成员

我们推出的新型C-WAVE BTS弥补了700nm和1000nm波长之间的差距。

  • 宽带连续波钛宝石激光器
  • 波长可调谐范围为 700 – 1000 nm
  • 输出功率高达 5 瓦——C-WAVE 系列中最高的功率
  • 非常适合用于晶格缺陷量子比特研究和高分辨率光谱学研究。

Cobolt Qu-T ™

Cobolt Qu-T™ 系列激光器可在700-850nm范围内提供可调谐且频率可锁定的单频连续波输出，其中心波长具有高度灵活性，并拥有完美的TEM00光束模式。每种发射波长均可实现数纳米的粗调谐（无间隙），并能进行数十千兆赫兹的精调谐（无模式跳跃）。
  • 707 nm、780 nm 和 813 nm，功率：500 mW
  • 支持多纳米无间隙粗调谐（>4 nm）
  • 快速精调（无模式跳变 >10 GHz，典型值）
  • 线宽 <50 kHz 
  • 非常适合用于激光冷却、纠缠光子产生、原子钟研究和干涉测量。

Ampheia ™光纤激光系统

全新 Ampheia™ 系列高功率光纤放大器和激光系统具有超低噪声和单频输出能力，可在 1064 nm 波长下提供 20 W、40 W 或 50 W 的功率，在 532 nm 波长下提供 5 W 的功率，并具有完美的光束和 >80dB 的边模抑制比 (SMSR)。

  • 在 1064 纳米波长下功率最高可达 50 W，在 532 纳米波长下功率最高可达 5 W。
  • 线宽小于 50kHz，相对强度噪声小于 -130dB/Hz
  • 非常适合用于光镊、半导体检测和激光泵浦。

Cobolt 06-01系列

Cobolt 06-01 系列提供多功能和先进的调制性能，具有完美的线性光学响应、真正的关闭状态以及从第一个脉冲开始就能在各种占空比、所有功率级别和全波长范围内提供稳定照明的特性。

该系列产品更将电子元件、光学组件与单模光纤耦合系统集成于坚固紧凑的平台之中，不仅大幅简化了与量子传感装置的集成流程，还具备无需校准维护、使用寿命长、占地面积更小等显著优势。
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什么是光谱仪？

任何光学光谱仪的核心部件都是按波长分离光线的组件。

最常见的是衍射光栅——一种刻有重复凹槽的材料片，当光线从其表面反射或透过时，会以与波长成比例的角度发生衍射和弯曲。

棱镜——或者光栅和棱镜的组合——也可以用来以这种方式弯曲和分离光线。这种按波长的弯曲和分离称为色散。

如果在色散元件后放置一个相机，我们就可以确定不同波长的光线落在相机上的哪个位置。

什么是光谱仪？插图

光学光谱仪的组成部分有哪些？

光源

光源的类型高度依赖于实验需求，例如激光器、HgAr校准灯、氘灯和样品发的光。

翻转镜

用于在需要快速切换多个实验装置时，在直接输入和侧输入输出之间进行切换。（镜面材料/涂层的选择会影响光谱仪的光通量效率）。

球面/环面镜

用于将狭缝或针孔发出的光进行准直，并将其导向衍射元件，同时将来自衍射元件的分散光聚焦到探测器上与波长相关的区域。（镜面材料/涂层的选择会影响光谱仪的光通量效率）。

衍射元件（如光栅、棱镜或光栅）

根据光的波长，用于将光分散到不同的角度。

（衍射元件材料/涂层的选择会影响光谱仪的光通量效率）。

探测器/摄像机

一旦光在光谱仪中按波长分散，通常希望用探测器或相机测量这些光。探测器/相机的

选择高度依赖于实验需求，通常最好由安多公司的专家与客户讨论后决定，基于客户

的实验要求。影响探测器/相机选择的因素包括光敏感度、时间门控、采集速度、光谱

范围、探测器宽度/高度、客户预算等。

Czerny-Turner光谱仪

切尼-特纳光谱仪是设计最为坚固和成熟的光谱仪之一。它使用一个弯曲（环形）的镜子来收集光源发出的光线，并将其准直（或使光线平行）后反射到平面衍射光栅上。该光栅安装在精密旋转台上，能够将光源发出的光线分散并反射到第二个弯曲（环形）的镜子上，该镜子将之前准直的光线聚焦到探测器上的不同位置，以检测每个波长的光线。通过旋转光栅，可以将不同范围的波长照射到探测器上。通过在光栅或光谱仪焦距之间切换，可以不同程度地分散光线，以实现不同的波长分辨率。

中阶梯光栅光谱仪

大多数光谱仪设计使用单轴色散——光仅在一个方向上按波长分离。当需要测量非常宽的波长范围时，多个衍射级次可能会重叠。然而，如果在设计中加入第二个色散元件，这些级次可以被分开，形成二维“阶梯图”，结合了宽带和高分辨率。阶梯光谱仪是极佳的选择，适用于同时测量从紫外到近红外的广泛波长范围，而不牺牲光谱分辨率。

什么是光谱仪？插图1

光谱仪是如何工作的？

光谱学过程

使用透射光谱仪测量样品在近紫外至可见光谱区域的吸收（或反射/透射/发射）。光谱仪由光源、色散元件、样品室和检测器组成。光源产生的宽带光通过色散元件转换为单色光，并穿过样品。样品后的光强度由检测器测量。通过扫描色散元件，可以产生并测量从近紫外到可见光的波长。通过比较样品后光的强度与样品前光的强度，生成透射光谱。早期的光源，如弧灯或金属丝，最近已被发光二极管（LED）取代。色散元件可以是单色仪中的棱镜或光栅。扫描式单色仪使用单个光电二极管检测器和光电倍增管，而固定式单色仪则使用CCD、光电二极管阵列。CCD和光电二极管阵列可以同时测量多个波长的光，从而实现更快的测量。

 

光谱仪的用途是什么？

光学光谱仪可用于多种不同的光谱技术，从紫外到NIR和SWIR，适用于各种尺寸和时间尺度。在以下章节中，我们将介绍不同的光谱技术，包括：

  1. 喇曼光谱法
  2. 发光／PL光谱学
  3. 吸收/透射光谱
  4. SFG/SHG光谱
  5. LIBS/OES光谱学
  6. 材料科学光谱学
  7. 化学与催化光谱学
  8. 表面增强拉曼光谱（SERS）技术
  9. 多维超快光谱技术
  10. 稳态荧光光谱技术
  11. 燃烧／流体动力学光谱

1.   拉曼光谱

拉曼光谱是一种非破坏性技术，用于测量样品的振动模式。拉曼光谱测量散射光，这些光可能因分子中振动能级之间的跃迁而失去或获得能量。产生的光谱极其具体地反映了样品的化学成分、分子环境和温度。拉曼光谱的一些应用包括用于药物质量控制、法医鉴定和远程爆炸物及毒品检测的化学品正确定位，作为凝聚态和气相系统中分子动力学的敏感探针，监测低维材料中的缺陷和应变，以及医学诊断。拉曼光谱的子类包括表面增强拉曼（SERS）共振拉曼、尖端增强拉曼、偏振拉曼和超拉曼。

  1. 发光／PL光谱学

发光是指物质在低温下自发地发出光（不是由热产生的）。发光的一些例子包括化学发光、生物发光和电致发光。光致发光是指物质吸收光子后自发地发出光。它被分为两个亚类；荧光，涉及单线态-单线态电子弛豫，发生在纳秒级；以及寿命更长的磷光，由三线态-三线态电子弛豫引起，可持续从微秒到数小时。磷光广泛用于表征半导体的光电性能、材料纯度和晶体质量，载流子寿命和应变效应。磷光还用于研究低维材料中的载流子动力学，例如纳米晶体中的量子限制效应。

  1. 吸收/透射光谱

吸收/透射光谱学是指样品对辐射的吸收随波长（或频率）变化的现象。吸收/透射光谱学可以在整个电磁频谱范围内进行，从高能X射线驱动内壳层电子激发，到低能无线电波辐射中电子和核自旋可以被激发。吸收/透射光谱学既具有特异性又具有定量性，在化学分析和量化样品中物种数量方面特别有用。它还用于远程传感应用，如天文学中的星际分子云化学成分分析，或作为原子和分子电子结构的敏感探针，可用于确定原子和分子的质量及几何结构。

  1. SFG/SHG光谱

和频生成（SFG）是一种非线性过程，其中两个角频率分别为ω1和ω2的光子在介质中相互作用，产生一个角频率为ω3的光子。由于信号强度取决于输入场的乘积，通常使用具有高峰值电场强度的激光器。二次谐波生成（SHG）是SFG的一个特例，此时ω 1 = ω2，是最常见的SFG类型。由于SFG只能在物质不对称的情况下发生，因此特别适用于表征表面和界面的特性。SFG还用于测量表面的电子和振动动力学。SHG是一种制造新型激光器的常用技术，也用于表征超短激光脉冲（低于1皮秒）。使用SHG的研究应用包括在高分辨率光学显微镜中检测非对称物质以及表征晶体材料。 二次谐波生成（SHG）是一种光谱技术，由于对称性限制，对测量分析物的表面具有独特的敏感性。SHG用于研究脂质体生物层和固体基底上的支撑双层的表面，允许研究膜表面生物分子的分子相互作用和脂质体双层中分子传输的动力学。

  1. LIBS/OES光谱学

光学发射光谱法（OES）是一种将样品加热到高温，使样品中的电子被激发到高能态的技术。随着样品冷却，电子弛豫并发出可见光谱区域（OES）的辐射。发射的辐射频率具有样品原子特性的特征，可用于确定材料的元素组成。有几种加热样品的方法；包括电感耦合等离子体（ICP）、火焰电离、电弧和火花。激光诱导击穿光谱法是发射光谱学的一个特定分支，其中高强度激光聚焦于样品上形成等离子体，使样品原子化并激发。电子从其激发态弛豫并在激发后几微秒内发出辐射。所得光谱可用于分析样品的元素含量。激光诱导击穿光谱法已应用于金属合金表征、危险物质检测、远距离化学物检测、爆炸残留物检测以及油漆和土壤中铅的检测。

  1. 材料科学光谱学在纳米、微米或宏观尺度上对固体进行操控和/或表征，以开发适用于太阳能/光伏电池、储能、LED、新型催化剂、化学检测器、生物医学设备等众多应用的新材料。该领域的许多研究人员能够以高精度和可重复性地表征各种材料的化学、结构、电子和/或光学性质，这些研究通常采用拉曼、光致发光/荧光/阴极发光、吸收、光发射光谱和激光诱导击穿谱、二次谐波生成或暗场散射等探测技术。研究人员经常测量结构变化、光子学特性、缺陷的存在、应变/应力下的行为、电子行为以及许多其他物理材料特性。近期感兴趣的材料包括：低维纳米晶体、过渡金属二硫属化物（TMDs）、有机半导体（如OLED）和等离子体超材料。
  2. 化学与催化光谱学

化学和催化领域有许多小众研究应用，涉及多种专门的光谱技术，这些技术通常需要高端的专业光谱仪器来高效收集足够的光谱数据。以下是用于化学和催化应用的一些技术示例。

红外（IR）光谱可用于监测化学反应的进程，因为分子的红外光谱高度依赖于原子组成和分子结构。此外，红外光谱还可用于监测分子中的同位素替换，因为力常数（从而振动频率）是系统简化质量的函数。

化学反应动力学机理可以通过UV/VIS（电子）光谱测量，并被应用于理解CO2活化和水分解的机制。

拉曼光谱可用于解决流体和液体样品的分子间模式。这些模式集中在光谱的低频（0-200 cm-1）区域，是样品的集体运动的结果，对分子间的分子间力特别敏感，并被认为在凝聚相化学反应动力学和动力学中起着关键作用。

  1. 表面增强拉曼光谱（SERS）技术

表面增强拉曼光谱依赖于金属纳米颗粒（或粗糙金属表面）在外加光源驱动下产生局部电场增强的能力。观察到的增强效果可达10^10至10^11倍，提高了该技术对单分子检测的灵敏度。SERS能够检测体液中低浓度的生物分子，并作为下一代医学诊断和早期疾病检测平台正在被探索。

 

  1. 多维超快光谱技术

超快光谱学用于研究通常发生在100飞秒（10^-15）时间尺度上的过程，而尖端实验现在正转向研究阿秒（10^-18）量级的过程。超快光谱学通常用于研究光化学反应，即化学反应由光引发。超快化学反应可以通过激光启动，分子的行为则通过红外或紫外-可见光谱学进行监测。

超快光谱学中的超快是指用于照射样品并启动或检测反应的光脉冲持续时间；而用于获取吸收光谱的探测器的工作频率为1 – 100 kHz。

这项研究的一个典型应用是研究防晒霜中分子的行为，以了解光照射下异构化或分解的变化。或者，可以利用光化学反应来更好地理解自然光合作用系统中的能量耦合。这些自然系统具有极高的量子效率，对其起源的深入了解有助于设计稳健的人工光合作用装置。

多维超快光谱学也可用于理解能量转移动力学，例如在二维红外实验中研究振动状态如何相互作用以及能量如何被淬灭。

  1. 稳态荧光光谱技术

稳态荧光光谱法可用于研究RNA-蛋白质相互作用的局部构象变化，因为荧光光谱的强度和形状高度依赖于局部环境，可以成为这些相互作用的极其敏感的探针。

  1. 燃烧／流体动力学光谱

研究流动的气体和液体在（有时）反应性环境中的行为。在这些领域中，了解分子能量和成分的流动对于设计更高效的发动机、车辆外观设计、涡轮机、反应堆以及许多需要考虑流体环境操作的其他工程设备至关重要。通常使用分子标记测速（MTV）或粒子成像测速（PIV）等测量方法来表征流体场中的湍流速度波动。这些技术常与其他技术结合使用，例如（平面）激光诱导荧光（(P)LIF），以测量流体温度并监测流动中的化学反应。相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）和化学发光等其他技术也是用于流体流动的有用光学诊断技术。

 

为什么光谱仪如此昂贵？

光谱仪本身并不昂贵——一个简单的光谱仪可以用一张光盘作为色散元件，用纸板框架固定。然而，构建高精度的光谱仪需要使用最佳的光学件和机械部件。镜子必须精确成型，以使光线达到最佳聚焦，并且要打磨得非常光滑，以避免强信号散射并淹没微弱信号。衍射光栅必须精确刻划，每毫米有数百到数千条线，每条线间距均匀且一致。电机必须在计算机控制下精确且可重复地移动。所有这些部件都必须牢固安装并校准在一个合适的机箱内，通常还需要额外的电动部件——旋转镜、可调狭缝、滤光轮等，以最大化系统的可用性。

没有一个单一的组件会主导生产成本，但一个功能齐全的高精度光学光谱仪就像其他计量资本设备一样——它需要技能、知识和精密部件来制造。

此外，光学光谱仪具有广泛的分析测量潜力。与提供类似材料表征能力的其他测量技术相比，光学光谱仪可能更胜一筹。

 

Andor紫外、NIR和SWIR光谱仪

当与适当的衍射光栅和检测器配合使用时，Andor Kymera 193i、Kymera 328i、Shamrock 163、Shamrock 500i、Shamrock 750是适用于UV、NIR和SWIR测量的光谱仪。

Andor光学光谱仪提供高分辨率、高通量、高模块化，从紫外到NIR和短波红外，从宏观到纳米尺度，光通量低至单光子，时间分辨率达到纳秒级。其特点包括高模块化、智能电机驱动、TruRes™——最高光谱分辨率、Adaptive Focus™技术，适用于拉曼、发光/磷光、吸收/透射、SFG/SHG、OES和LIBS、材料科学、化学与催化以及生命科学/生物医学等领

域。

Andor光谱型相机和探测器

基于光谱学的诊断在材料科学、化学、生命科学或基础物理和光学领域依赖于以高度精确度捕获和分析光学和化学特征。

Andor光谱相机和探测器系列提供广泛的灵敏度、时间分辨率和传感器格式，以最适合从紫外到短波红外、纳秒到小时的时间分辨率、高光子通量到单光子的超动态范围和分辨率的特定实验条件。

什么是光谱仪？插图2

原文链接：https://andor.oxinst.com/learning/view/article/what-is-an-optical-spectrometer

返回产品链接：https://www.star-spectrum.com/home-products/

原子光谱

原子光谱法

原子谱是通过电磁谱或质谱确定元素组成的。对元素电磁波谱的研究称为原子光谱学。

电子存在于原子内的能级中。这些能级具有明确定义的能量，在它们之间移动的电子，必须吸收或发射等于它们之间差值的能量。

在它们之间移动的电子必须吸收或发射与它们之间的差相等的能量。在光谱学中，将电子移动到较高能级所吸收的能量和/或电子移动到较低能级所发射的能量以光子的形式存在。所发射的波长与所发生的电子跃迁有直接关系。由于每种元素都有独特的电子结构，因此发出的光的波长是每种元素的独特属性。由于大原子的轨道构型可能是复杂的，因此会发生许多电子跃迁，每个跃迁都会产生一个特征波长的光，如下图所示。

原子光谱插图

 能源转型

原子光谱学产生了三种用于分析的技术：原子吸收、原子发射、原子荧光。激发和衰变为基态的过程涉及原子光谱学的所有三个领域。测量激发过程中吸收的能量或衰变过程中发射的能量，并将其用于分析目的。

原子光谱插图1

这三种技术是如何实现的

如果恰到好处波长的光撞击到自由的基态原子上，该原子可能会在进入激发态时吸收光，这个过程称为原子吸收。此过程如上所示。原子吸收率测量的是共振波长的光在穿过原子云时被吸收的量。随着光路中原子数量的增加，吸收的光量以可预测的方式增加。通过测量光的吸收量，可以对存在的分析物元素的量进行定量测定。使用特殊光源和仔细选择波长，可以在其他元素存在的情况下对单个元素进行特定的定量测定。

原子光谱插图2

原子吸收测量所需的原子云是通过向样品提供足够的热能以将化合物解离成自由原子而产生的。将样品溶液吸入对准光束的火焰中即可达到此目的。在适当的火焰条件下，大多数原子将保持基态形式，并且能够吸收来自光源灯的分析波长的光。原子吸收法简便、快速，可以进行精确、准确的测定，这使原子吸收法成为测定金属最常用的方法之一。

原子光谱插图3

原子吸收过程

在原子发射中，样品受到高能热环境的影响，以产生能够发光的激发态原子。能量源可以是电弧、火焰或最近的等离子体。

暴露于这种能量源的元素的发射光谱由一组允许的发射波长组成，通常称为发射线，因为发射波长的离散性。该发射光谱可用作定性识别元素的独特特性。使用电弧的原子发射已广泛用于定性分析。发射技术还可用于确定样品中存在多少元素。对于“定量”分析，测量在待确定元素波长处发射的光的强度。随着分析物元素的原子数的增加，该波长的发射强度将更大。火焰光度法技术是原子发射用于定量分析的一种应用。

原子光谱插图4

与原子光谱相关的 ICCD 量子效率

原子光谱学的第三个领域是原子荧光。该技术结合了原子吸收和原子发射的各个方面。与原子吸收一样，在火焰中产生的基态原子是通过将光束聚焦到原子蒸气中而被激发的。然而，它不是查看过程中吸收的光量，而是测量由光源激发的原子衰变产生的发射。这种“荧光”的强度随着原子浓度的增加而增加，为定量测定提供了基础。用于原子荧光的光源与光学系统的其余部分成一定角度安装，因此光检测器只能看到火焰中的荧光，而看不到灯本身的光。最大化灯强度是有利的，因为灵敏度与激发原子的数量直接相关，而激发原子的数量又是激发辐射强度的函数。

虽然原子吸收是这三种技术中应用最广泛的，并且通常比其他两种技术具有多种优势，但在特殊分析情况下，发射或荧光可能会获得特殊优势。

 

原文链接：https://andor.oxinst.com/learning/view/article/atomic-spectroscopy

光谱学基础-历史、解释和应用

光谱学基础-历史、解释和应用

原子光谱学涉及原子与光的相互作用；

而分子光谱学涉及分子与光的相互作用。

原子光谱学提供有关样品的原子或元素身份的信息；

而分子光谱学可以揭示有关分子身份和分子结构的信息。

 

涉及原子光谱与分子光谱的跃迁类型不同：

在原子光谱中，通常观察到的是电子态跃迁；

而在分子光谱中，除了电子态跃迁外，还可以研究振动和旋转跃迁。

 

本文重点介绍分子光谱。

 

 

光谱实验装置

根据所用技术的不同，光谱实验的单位也不同。

图1列出了电磁（EM）光谱中的一些关键区域、这些区域内常用的一些光谱技术、每种技术探测的跃迁类型以及使用的单位。

例如，紫外可见吸收光谱涉及分子中价电子的跃迁，以波长(λ)为单位报告，如纳米（nm）

或埃(A)。

红外吸收光谱则研究分子振动，通常以波数（cm-1）为单位报告。

光谱学基础-历史、解释和应用插图

图1：电磁频谱（EM）、使用的光谱技术、涉及的跃迁和光谱单位。EM图像取自参考文献1

 

吸收光谱学是电磁辐射因与物质相互作用而随频率变化的吸收过程。

想象一下，样品在比色皿中与不同类型的光相互作用，如图2所示。当样品吸收不同类型光时，会激发出不同类型的跃迁。

例如：

X射线激发的是原子核电子的跃迁，

紫外光激发的是价电子的跃迁，

红外辐射激发的是分子振动，

微波区域激发的是分子旋转，

在射频（RF）下则激发电子和原子核。

光谱学基础-历史、解释和应用插图1

图2：根据所用光的类型，激发分子的不同类型的跃迁。

 

紫外-可见吸收光谱

紫外-可见吸收光谱在分子中涉及激发分子轨道之间的价电子。

两个重要的分子轨道是最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占分子轨道（LUMO）。

对于处于基态的分子，HOMO被电子占据，而LUMO则没有。

在紫外-可见吸收实验中，一个电子会从HOMO激发到LUMO。当从基态激发到激发态时，还可以发生振动和旋转跃迁。

紫外可见吸收光谱仪由宽带光源、色散元件、波长选择器、检测器和记录器组成，如图3.2所示

光谱学基础-历史、解释和应用插图2

图3：单光束（上）和双光束（下）UV-Vis分光光度计。图摘自参考文献2

 

在紫外可见光谱实验中，通过计算透过参比样品的光强度与透过样品的光强度之比的对数，来计算样品的吸光度A，其中，透过参比样品的光强度与透过样品的光强度之比是随波长变化的函数：

光谱学基础-历史、解释和应用插图3

这可用于使用比尔-朗伯定律或比尔定律计算样品中吸收物质的浓度：

光谱学基础-历史、解释和应用插图4

其中，ε是摩尔吸光系数，表示样品中吸收物质对特定波长光的吸收强度，通常以M-1cm-1表示。c是吸收物质的浓度，单位为摩尔浓度M，d是光与样品相互作用的距离（有时称为路径长度）。比尔定律在吸光度介于0.2至0.8之间时效果最佳。双光束紫外-可见光谱仪通过使用分束器同时激发参比和样品，使这一测量更加便捷。这使得可以同时收集参比和样品的强度。

比尔定律的一个例子是用于测量样品中的蛋白质浓度，例如在重组蛋白生产中发现的样品。蛋白质含有如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等氨基酸，这些氨基酸具有芳香基团，在紫外光下吸收强烈。通过在280纳米处测量样品的吸收并应用比尔定律，可以估算出蛋白质的浓度，如图4.3所示。尽管这种方法可能不够准确，因为核酸材料通常存在于这些样品类型中，且会吸收紫外线，但考虑到不同蛋白质中这些氨基酸的比例不同，该方法仍可用于监测重组蛋白产品的纯化过程。商用的纯化仪器，如HPLC系统，通常使用基于紫外可见光谱的检测。

光谱学基础-历史、解释和应用插图5

图4：用于通过紫外-可见光谱法测定蛋白质浓度的三种氨基酸。左侧图表显示了(a)苯丙氨酸、(b)色氨酸、(c)酪氨酸的紫外-可见吸收光谱。右侧图表显示了根据比尔定律获得的280纳米处的吸光度与蛋白质浓度的关系。紫外-可见吸收光谱数据来自参考文献3。

 

光致发光——荧光和磷光

光致发光是指物质吸收光子后发出的光。

它分为两种类型：荧光和磷光。

荧光相对较强且快速，时间尺度在皮秒（ps）到纳秒（ns）之间。

相比之下，磷光较弱且缓慢，时间尺度在微秒（μs）或更长。

与激发波长相比，荧光和磷光都会发生红移。

Jablonski图，以Aleksander Jabłonski命名，是理解分子中不同类型的光物理过程的有用工具，如图54所示。本图描述了分子的基态和激发态电子状态、基态和激发态电子状态内的振动和转动能级、这些状态的电子自旋性质以及所有这些状态之间可能发生的跃迁类型。

光谱学基础-历史、解释和应用插图6

图5：Jablonski图，描述了分子中可能的光物理过程。图片摘自参考文献4。

 

当一个处于激发态的电子通过发射光子而从激发态回到基态时，就会产生荧光。

当基态和激发态都是单重态时，就会发生荧光。

还可能发生的是，处于单重态的电子在受到电激发后，可以通过系统间跃迁（IC）进入一个电子激发的三重态自旋状态。根据量子力学原理，激发的三重态电子通过直接光子发射弛豫到基态是被禁止的。然而，由于自旋-轨道耦合的作用，这种类型的跃迁确实会发生，这一过程正是磷光的起源。

荧光光谱仪的示意图如图6.5所示。光源可以是宽带光源或窄带激光器，通过透镜聚焦到样

品上，样品中的电子从基态激发到激发态。当电子从激发态弛豫到基态并发射一个光子

时，通过放置一个透镜收集发出的荧光，通常该透镜与激发路径呈90度角，以减少来自激

发源的背景干扰，并将荧光聚焦到单色仪中进行检测。然后数据被发送到记录器，在那里

测量的荧光以发射光强度随发射波长的变化形式报告。

光谱学基础-历史、解释和应用插图7

图6：荧光光谱仪示意图。图片摘自参考文献5。

以荧光素的吸光度和荧光光谱为例，如图7.6所示。荧光素是一种用于生物成像的染料。吸收光谱用蓝色表示，荧光光谱用红色表示。可以看出，荧光光谱相对于吸收光谱发生了红移。这被称为斯托克斯位移。荧光光谱还像是吸收光谱的倒置，这是荧光实验中常见的现象。

光谱学基础-历史、解释和应用插图8

图7：荧光素的吸收（蓝色）和荧光（红色）光谱。荧光光谱从吸收光谱中红移，并且呈现为“镜像”形式。光谱摘自参考文献6。

荧光测量中一个重要量是荧光量子产率Φ，即分子发射的光子数除以分子吸收的光子数：

光谱学基础-历史、解释和应用插图9

Φ的最大值为1，此时分子每吸收一个光子就发射一个光子；最小值为0，此时分子不发射任何光子。

可以使用脉冲激光和时间分辨检测方案进行时间分辨荧光测量。近红外荧光蛋白（ iRFP）是一类用于生物成像的基因工程荧光探针。几种iRFP的稳态吸收和荧光光谱如图8.7所示。

光谱学基础-历史、解释和应用插图10

图8：近红外荧光蛋白的左稳态荧光光谱。摘自参考文献7。

这些蛋白质吸收和荧光都偏向NIR方向，因此特别适用于深层组织成像，因为长波长的光比短波长的光能穿透更深的组织。图9.7展示了iRFP702在H2O and D2O中，激发波长为660 nm， 发射波长702 nm的时间分辨荧光光谱。

光谱学基础-历史、解释和应用插图11

图9：iRFP 702在660 nm处发射并在702 nm处检测到的时间依赖性荧光光谱在水（红色）和D2O中显示了动力学同位素效应。底部的曲线是相同的衰减曲线，但强度采用对数刻度。取自参考文献7。

 

可见荧光强度随时间衰减，衰减时间从几百皮秒（ps）到几十纳秒（ns）不等，这种时间依赖性荧光强度可描述为：

光谱学基础-历史、解释和应用插图12

其中，I(t)是激发后时间t的荧光强度，Io是初始荧光强度，τ是荧光寿命，即I(t)达到初始值（Io）的1/e的强度所需的时间。

iRFP 702在两种溶剂中的荧光寿命不同。在水溶液中，测得的荧光寿命为749皮秒，而在氘水中则为1.35纳秒。氘水中的荧光寿命比水溶液长，这可以归因于较重的氘同位素的存在，导致这两种溶剂中iRFP 702的荧光寿命的动力学同位素效（KIE）应为1.8。

福斯特Förster共振能量转移（FRET）是两种荧光团之间发生的荧光过程。在FRET中，两个荧光团被放置得非常接近，其中一个荧光团（FRET供体）的发射光谱与另一个荧光团（FRET受体）的吸收光谱重叠，形成一个FRET对。当供体分子从基态激发到激发电子态时，可能会发生非辐射能量转移，供体激发受体，随后受体荧光，如图10.8所示。

光谱学基础-历史、解释和应用插图13

图10：显示FRET对之间Forster共振能量转移的Jablonski图。图片摘自参考文献8。

FRET的效率高度依赖于距离，随1/r^6变化，其中r是供体和受体之间的距离。由于这种强烈的距离依赖性，FRET仅在供体和受体相距几纳米时发生，在超分辨率定位成像以及检测和追踪蛋白质相互作用中具有应用。

 

磷光被广泛用于表征“下一代”材料，如纳米材料、低密度材料和新型半导体。这些材料在光伏、能源生成和太阳能电池中有着广泛的应用。磷光实验的设置与荧光实验非常相似，如图11所示。

光谱学基础-历史、解释和应用插图14

图11：磷光光谱仪示意图。

氮化镓纳米结构是下一代材料的一个例子，因其磷光发射在蓝色范围内而受到关注，这使得它们成为用于蓝色LED和基于二极管的激光器的理想候选材料。如图129所示，磷光被用来表征氮化镓纳米结构的质量。通过使用xy平移台，研究人员能够生成磷光整体强度的地图，并通过监测370 nm处缺陷带的存在或不存在来识别纳米结构中的缺陷，此外还有360 nm处的正常磷光发射。

光谱学基础-历史、解释和应用插图15

图12：左下角-基于氮化镓的纳米结构阵列的总PL强度随xy位置的变化。右下角-基于氮化镓的纳米

结构阵列的代表性PL光谱，显示主要PL发射波长为~360 nm，检测带宽为~370 nm。改编自参考文献9。

 

研究人员一直在寻找替代传统晶体硅的材料，用于薄膜太阳能电池板中的薄膜吸收层，以降低生产成本并提高可持续性。铜锌锡硫化物（CZTSSe）被认定为一种可行且特别有吸引力的候选材料，因为它仅由低毒性的丰富材料组成。通过定量磷光可以获取这些材料电子结构的信息，从而预测使用这种材料时设备的开路电压。这一点很重要，因为可以在生产过程早期进行测量，而无需制造整个太阳能电池装置来获得这些信息。

在图13所示的实验中，10到12名研究人员通过引入一层称为缓冲层的半导体材料，能够改变CZTSSe的电子特性，并使用定量磷光技术监测这些变化的影响。利用几种缓冲层对1.05电子伏特以下磷光强度的影响，最终预测了不同缓冲层下材料在器件中的性能。

光谱学基础-历史、解释和应用插图16

图13：在铜锌锡硫化物（CZTSSe）吸收器上测量的底部-PL光谱，使用了多种缓冲液。改编自参考文献10-12。

 

拉曼光谱技术

拉曼光谱可以作为分子振动和旋转的高度敏感探针。这一技术最初由印度物理学家C.V.拉曼发现，他在1928年发表于《自然》杂志的一篇题为“辐射的负吸收”的论文中公布了研究成果。

与红外吸收光谱不同，后者通过直接吸收能量等于分子振动和旋转跃迁的红外光 来探测分子的振动和旋转，拉曼光谱的工作原理则有所不同。

在拉曼实验中，使用一个不与分子中的任何振动或旋转状态共振的激发源，将分子中的电子激发到电子虚态，从而产生散射事件。

最常见的散射事件是瑞利散射，即光子与分子弹性散射，且这些光子的能量在散射后不会改变。

然而，光子可以与分子发生非弹性散射，在这种情况下，散射后光子的能量减少相当于分子的一个振动或旋转能级——这被称为斯托克斯拉曼散射。此外，光子也可以与分子发生非弹性散射并获得能量，此时获得的能量相当于分子的一个振动或旋转能级。这被称为反斯托克斯散射。无论是斯托克斯散射还是反斯托克斯散射，效率都相对较低，大约只有10^-7的光子会发生非弹性散射。这些不同的过程如图14.13所示。

光谱学基础-历史、解释和应用插图17

图14：拉曼光谱中的能量水平和散射事件。摘自参考文献13。

图1514显示了拉曼光谱仪的示意图。用光激发样品，产生的散射光通过滤波器降低瑞利散射的强度，然后进入光谱仪，在那里分散并由探测器收集和记录。

光谱学基础-历史、解释和应用插图18

图15：拉曼光谱仪示意图。摘自参考文献14。

拉曼光谱中常用的单位是波数（cm-1）。然而，拉曼光谱的独特之处在于，样品中振动或旋转跃迁对应的单位总是相对于激发源的能量，即瑞利线来报告。例如，假设在435.83纳米激发时观察到一个未知的拉曼带位于457.4纳米。根据公式：

光谱学基础-历史、解释和应用插图19

其中h为普朗克常数，c为光速，λ为光波长，激发源的能量为：

光谱学基础-历史、解释和应用插图20

而非弹性散射光的能量为：

光谱学基础-历史、解释和应用插图21

这导致了1082 cm-1的能量，从而产生了在457.4 nm处的未知带：

光谱学基础-历史、解释和应用插图22

拉曼信号基于散射事件，其强度与激发波长的四次方成反比，即1/λ4，因此使用较低波长的激发源可以增加拉曼信号的强度。

拉曼“光谱密度”，即在给定能量下，拉曼模式在波长空间中的相互接近程度，在很大程度上取决于激发源的波长以及所研究模式的光谱区域。

例如，考虑一个实验目标是使用拉曼光谱测量能量范围从0到4000 cm-1的分子振动和旋转。

如果选择262纳米作为激发源，则最高能量模式在4000 cm-1处会出现在292.7纳米，即比激发源红移~30纳米。

然而，如果选择785纳米作为激发源，则同一模式在4000 cm-1处会出现在1144纳米，红移接近360纳米。

这种光谱密度对激发波长的依赖性要求在设计拉曼实验时，应仔细考虑光谱仪的带宽和分辨率以及所用探测器的波长依赖量子效率。

拉曼光谱是一种高度特异性的非破坏性技术，这种特性可以用来以多种方式表征材料。

它可以用来识别未知化学物质，如图16.15所示的六氯苯。

光谱学基础-历史、解释和应用插图23

图16：六氯苯的拉曼光谱。摘自参考文献15。

它还可以用作量化过渡金属二硫属化物（TMDC）型单层的化学成分的一种方法，如MoS2和WS2，通过测量Mo1-xWxS2单层合金中Mo相对于W的摩尔分数，如图17.16所示。

光谱学基础-历史、解释和应用插图24

图17：Mo1-xWxS2单层合金的拉曼光谱，随W与Mo摩尔分数的变化。摘自参考文献16。

多层纳米材料的增长也可以通过观察MoS2中拉曼模式随层数变化的情况来监测，如图18.17所示。当材料中的层数从1增加到4时，拉曼光谱中会出现额外的模式，这些模式归因于材料中的呼吸和剪切模式。这些模式涉及多层之间的运动以及一层运动对另一层的影响。这种依赖于多层的运动仅在具有多个层次的样品中才可能出现，在单层拉曼光谱中并不存在。

光谱学基础-历史、解释和应用插图25

图18：二硫化钼的拉曼光谱随层数的变化。随着层数的增加，更多的拉曼模式变得明显。摘自参考文献17。

 

分子结构的差异，如水和冰中的差异，也可以通过拉曼光谱来表征。尽管水和冰的化学组成相同，但图19.18显示，水的拉曼光谱中O-H伸缩带比冰宽得多，这反映了水中的OH基团可以自由探索更多的振动和旋转子空间，而在冰中则更为受限。

光谱学基础-历史、解释和应用插图26

图19：水和冰的拉曼光谱，显示了液相与固相中OH伸缩模式线形的依赖性。摘自参考文献18。

拉曼光谱可用于测量材料中的应变和缺陷。图20比较了纯石墨与经过长时间球磨处理的石墨样品的拉曼光谱。19在石墨中观察到的二维带在24小时球磨后，其双峰轮廓被抑制并转化为单峰，“类似突起”的模式。

拉曼光谱特征的细微差异可用于区分非常相似的材料，如石墨烯和石墨。石墨烯是由原子以六角晶格纳米结构排列而成的一层单分子层，而石墨则由多层石墨烯堆叠而成。图20.20展示了N掺杂石墨烯和高度取向热解石墨（HOPG）的拉曼光谱。N掺杂石墨烯中的二维带相对于石墨的二维带略有红移。此外，石墨中存在多个模式，导致其二维带的线形与石墨烯不同。这种差异是由于石墨中含有多层石墨烯。N掺杂石墨烯中观察到的D带被称为缺陷或无序带，归因于样品中的氮掺杂。

光谱学基础-历史、解释和应用插图27

图20：(a)：N掺杂石墨烯（上）和高取向热解石墨（HOPG）（下）的拉曼光谱。(b)：N掺杂石墨烯和HOPG的二维能带放大图，显示了两种材料线形的差异。摘自参考文献20。

金属和半导体单壁碳纳米管（SWCNT）也可以通过拉曼光谱进行区分。图21顶部的曲线显示了金属SWCNT的拉曼光谱，而底部的曲线则展示了半导体SWCNT的拉曼光谱。21金属样品与半导体样品的G模式光谱展宽程度不同，用于区分两种类型的SWCNTs。

光谱学基础-历史、解释和应用插图28

图21：金属（上）和半导体单壁碳纳米管（SWCNT）的拉曼光谱。拉曼光谱中的差异，如G带的展宽，可用于区分金属和半导体类型的样品。摘自参考文献21。

 

参考文献：

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原文链接：

https://andor.oxinst.com/learning/view/article/fundamentals-of-spectroscopy-history-explanations-and-applications

用于显微镜的折射式自适应光学元件Refractive Adaptive Optics for Microscopy

自适应光学的英文名为Adaptive optics，简称 AO。 AO是指一系列强大的图像校正技术，已证实对多种生命科学显微镜的方法具有优势。然而，传统AO系统的额外复杂性和成本，使得自适应光学 (AO)无法在显微镜中的广泛应用。 德国Phaseform厂家开发了折射式、完全在线的AO系统，可以减少许多复杂的设置和降低成本。

在本应用说明中，我们探讨了我们的折射式AO概念如何增强显微镜能力，并通过宽视场AO荧光显微镜来展示这一点。

用于显微镜的折射式自适应光学元件Refractive Adaptive Optics for Microscopy插图

图1:油/水浸泡显微镜设置。

自适应光学AO在显微镜中的应用

人们常说，从显微镜到照相机和望远镜，光学成像系统的好坏取决于它们的光学性能。这可能是真的，但图像的好同时也取决于中间介质好，只有在中间介质允许的情况下，成像质量才会好。

在许多情况下，现代显微镜的性能，产生像差的来源有2个方面：其一是：被测样品和物镜之间的折射式率不匹配，导致球面像差。其二是：被测样品的形状以及折射式率的变化，导致依赖于样本本身的复杂像差。这种来着像差的“挑战”在单分子和深层组织的成像中更为严峻。如果不加以修正，它们会降低所获取图像的对比度和清晰度 [1-2]，阻止显微镜达到其理论分辨率。

在过去的二十年里，在显微镜中使用自适应光学的广泛研究已经证明了它的有效性。AO可以补偿像差并恢复显微镜的原始性能，而不受被测样品和样品架类型的影响，从而有助于放宽指数匹配标准并缩短被测样品制备时间。AO几乎适用于所有高级显微镜技术：共聚焦（confocal,）、宽视场（wide-field）、多光子（multi-photon）甚至超分辨率（super-resolution）方法，比如如 STED、SMS、STORM。特别是对于深层组织成像显微镜（一种独特地允许在自然环境中检查细胞的显微镜），AO可以在远低于被测样品表面的地方保持最佳分辨率。

 

自适应光学AO的商业化之路

在专业的天文学应用中，自适应光学AO子系统无处不在，但是AO自适应光学技术在显微镜应用中的发展很缓慢。这其中的主要原因是，相比于专业天文学，显微镜的成本较低，此外显微镜通常在尺寸上小得多，并且由折射式工作原理的透镜组成。

尽管如此，在最先进的显微镜领域一块，已经产生了第一个把商业自适应AO系统用于显微镜的解决方案。 它们作为显微镜扩展端口的附件。在内部结构中，他们通过将光瞳平面传递到可变形镜 (DM) 来执行波前测量和校正，并在校正后将光重新引导回显微镜的检测/成像路径。

但是，这些第一代产品需要仔细设置，不能普遍兼容，而且依然相对笨重。

用于显微镜的折射式自适应光学元件Refractive Adaptive Optics for Microscopy插图1

图2:传统的自适应光学显微镜使用可变形的镜子来施加光路的折叠

用于显微镜的折射式自适应光学元件Refractive Adaptive Optics for Microscopy插图2

图3:Phaseform为直接集成开发了完全在线自适应光学系统

 

Phaseform 全折射式AO显微镜

Phaseform 的愿景是让大多数显微镜用户都能使用自适应光学技术。 为了提供具有不妥协性能的集成、更紧凑的AO解决方案，我们认为，从反射波前调制到折射式波前调制的技术转变是必要的。因此，我们提出了一种专为显微镜设计的新型完全在线AO系统（图 3）。

 

Phaseform的AO显微镜是通过以下2点，优化了传统AO系统来实现的：

(A) 可变形反射镜替换成折射式DPP变形镜

(B) 省略波前传感器，改用像差估计算法。

 

折射式 DPP变形镜——自适应AO显微镜的关键技术

Phaseform相位调制变形镜DPP(Deformable Phase Plate)，如图 4 所示，是一种新型的动态光学元件。它的名字来自传统的变形镜，一种带有表面浮雕的透明材料薄板，用于补偿高级显微镜应用中的固定像差。然而，与那些不同的是，DPP 的表面可以通过跨越通光孔径的63个致动器阵列动态地塑造成任何任意形式[3]。 因此，它是可变形反射镜的折射式替代品。

用于显微镜的折射式自适应光学元件Refractive Adaptive Optics for Microscopy插图3图 4：折射式 63个致动器-相位调制变形镜DPP，能够校正径向7阶Zernike模式。

DPP相位调制变形镜 用于显微镜的主要优点是：

  • 透射式：可以插入任何光路中，无需重新计算、重新成像或折叠光路。
  • 尺寸紧凑：作为超薄透射元件，DPP变形镜 从系统的角度来看已经提供了空间节省，但其占用空间小，特别适合集成，甚至可以连续堆叠多次。
  • 高效：它的操作与偏振无关，并且显示出有限的衍射损耗。
  • 多功能：自动校正一阶和二阶球差和散光对于显微镜应用特别有用。 然而，更复杂的像差，例如在深部组织成像中由不同折射式率的区域导致的像差，需要更高阶的校正，DPP 可以提供，类似于DM。
  • 动态：可以在高分辨率成像和显微镜设置中实时控制和操作DPP

无波前传感器的估算法SWE（Sensorless Wavefront Estimation）

光学像差的预知对其校正至关重要。 波前传感器，例如Shack-Hartmann传感器或干涉仪，通常用于经典AO系统中来测量动态像差。 然而，使用波前传感器一方面增加了AO系统的复杂性和成本，同时也不是一个实用的解决方案。尤其是对于显微镜应用，可能仅仅是因为显微镜设置的限制，甚至是由于所研究标本的性质而受限制。而SWE无波前传感器估算法（Sensorless wavefront estimation）是一个替代方案，可替代传统AO显微镜中的波前传感器，在这种情况下，像差动态是缓慢和相对小的。

 

SWE算法的两个一般要求是：

  1. 了解样本或成像目标，从而创建有效的品质因数，例如图像清晰度或对比度。这是基于针对波前调制器的不同布置对一系列捕获图像进行定量优化的实际像差估计，所必需的。
  2. 为所采用的波前调制器提供一个可预测的和稳健的控制方案。波前调制器需要放在几个精确的相对配置中，才能有效地实施任何 一种SWE 方法。PhaseformDPP的静电驱动原理和直观的控制算法特别适合此类任务[4-5]。

 

尽管SWE估算法的代价是增加了计算负载，牺牲了图像采集时间。但通过SWE大大降低了AO系统的硬件复杂性（如下面的案列展示）。此类方法的不同变体的优势已在许多高端显微镜模式中得到证明，例如共聚焦、双光子荧光、结构化照明、光片、STED 和 SMS [1-2]。

 

案例展示：即插即用自适应光学显微镜

DPP的传输工作原理与SWE相结合，使即插即用的AO系统成为可能。与安装在传统笼中的透镜类似，DPP可以插入显微镜的光路中，最小到零中断，以提供系统和样品引起的像差的动态校正。图5描述了Phaseform的Delta 7形式的DPP集成到商业(图5a和5b)和定制显微镜(图5c和5d)的4个示例。例子包括荧光宽视场和高端双光子显微镜成像深入到生物样品。SWE和DPP的传输特性使其易于集成为折光直列系统。

用于显微镜的折射式自适应光学元件Refractive Adaptive Optics for Microscopy插图4

图5:商用和定制显微镜中基于dpp的AO系统的示例。(a)商用显微镜物镜和转塔之间集成的DPP。(b) DPP集成在商用显微镜的共轭瞳孔平面上，使用连接到相机端口的中继光学器件。(c)用于荧光宽视场成像的“世界上最小的AO显微镜”[5]。(d)将DPP集成到定制的双光子显微镜的照明路径中(与Prof。Alexander Jesacher，因斯布鲁克医科大学)[10]。

 

AO在显微镜中的优势如图6所示。描述了深入样品的双光子成像的实例结果，以及系统和样品诱导像差的波前无传感器补偿。左边的(a)列显示了在没有和有AO校正的情况下，对超过150 μm深的小鼠脑切片进行神经元成像的结果(与因斯布鲁克医科大学Alexander Jesacher教授小组合作)。柱(b)为球体样品40 μm深度成像结果。该实验是在与Prospective Instruments (Stefanie Kiderlen博士和Lukas Krainer博士)合作的双光子显微镜(MPX-1040)中安装DPP完成的。

用于显微镜的折射式自适应光学元件Refractive Adaptive Optics for Microscopy插图5

图6:通过(a)定制和(b)商业获取的各种样品的图像(MPX-1040, Prospective Instruments)使用DPP进行无波前传感器AO校正的双光子显微镜。

 

结论

Phaseform认为，折射波前调制器和像差估计算法的最新技术进步将彻底改变自适应光学显微镜。我们设想一个未来，就像在天文学中发生的那样，自适应光学将成为每一台自建和每一台商用显微镜的默认配置。这个未来可能比我们想象的更近。

 

 

※※※※※※   关于我们   ※※※※※※

用于显微镜的折射式自适应光学元件Refractive Adaptive Optics for Microscopy插图6

上海星谱科技有限公司，是一家专业从事光电仪器代理，技术开发，以及技术服务的设备供应商。我们与全球范围内专业的仪器生产商紧密合作，提供光学领域的专业服务，其中涉及

细分领域包括：拉曼、全息、荧光、时间分辨、单光子、量子、显微成像、超分辨、非成像光学设计、光学系统、激光雷达、SRS、瞬态吸收、纳米定位……

涉及产品类别包含：激光器、宽谱光源、SLED、荧光光源、滤光片（含红外滤光片、紫外滤光片）、光谱仪、相机、单光子探测器、条纹相机、超连续谱、白激光、日盲滤波探测器、高光谱系统、SDK、TCSPC系统……

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用于3D增强现实眼镜的波导全息技术——新研究

增强现实(AR)和虚拟现实(VR)向未来迈进的重要一步。META Reality Labs与首尔国立大学合作，使用Cobolt Samba 532 nm激光器，推出了突破性的紧凑型全息近眼显示概念。这个原型解决了当前技术面临的关键挑战，为用户提供了身临其境和舒适的视觉体验。

正如研究人员在《 Nature Communications》杂志上所讨论的，这一概念旨在克服诸如实现紧凑的外形因素、解决收敛性冲突以及通过大眼箱获得高分辨率等障碍。传统上，这些挑战一直是追求创造真正的3D全息增强现实眼镜的绊脚石。

这一进步的关键在于一种细致的方法来模拟相干光的相互作用和传播通过波导合成器。研究人员展示了他们利用位于输入耦合器侧的空间光调制器来控制输出波前的能力。该方法通过出瞳扩展波导组合器促进3D全息显示，提供了一个大尺寸，软件可操纵的眼箱。

此外，该方法还带来了额外的好处，包括通过抑制瞳孔复制过程引起的相位不连续而实现的分辨率增强能力。这些功能的结合使全息近眼显示概念成为下一代计算平台的有前途的候选者，并有可能影响AR和VR技术的未来。随着技术的不断进步，真正的3D全息增强现实眼镜的前景越来越接近现实。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-44032-1

量子应用激光器，有了新选择

紧凑可调谐激光器 丨 单频 丨无跳模调谐

HÜBNER Photonics最新发布了一系列应用于量子技术的激光器。其中，Cobolt Qu-T 系列是一系列结构紧凑、单频可调谐激光器，工作波长分别为707 nm、780 nm和813 nm。具有＞4 nm的粗调、＞5 GHz的窄模无跳模微调、＜100 kHz的线宽和500 mW的功率，意味着Cobolt Qu-T 该系列非常适合基于原子跃迁和通过自发参量下转换生成纠缠光子对的量子实验。

量子应用激光器，有了新选择插图

Cobolt Qu-T激光器在一个小型且易于使用的平台上，使用Cobolt HTCure技术进行紧凑型密封封装，可以在多种运行条件下提供24/7强大的可靠性能，因此也有助于将最先进的量子研究装置带入现实世界。

产品特点

  • 波长灵活性和高输出功率
  • 窄线宽（<100 kHz，自由运行）
  • 高光谱纯度（SMSR>60 dB）
  • 无间隙粗调（>4 nm）
  •  快速微调（模式无跳模>5 GHz，典型值）
  •  频率锁定到各种外部参考
  •  紧凑小巧，高可靠性

典型应用

  • 激光冷却   Laser Cooling
  • 纠缠光子产生 Entangled Photon Generation
  • 原子钟研究 Atomic Clock Research
  • 高分辨率光谱 High Resolution Spectroscopy
  • 干涉测量 Interferometry

激光器参数

量子应用激光器，有了新选择插图1

激光器测试结果

01
SMSR边模抑制比
量子应用激光器，有了新选择插图2
02
光斑品质

量子应用激光器，有了新选择插图3

型号配置选型

量子应用激光器，有了新选择插图4

激光器外形尺寸

量子应用激光器，有了新选择插图5
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TCSPC的经典原则

张杰

TCSPC的经典原则插图 TCSPC 在激光脉冲后的光子时间上建立光子分布

时间相关单光子技术（TCSPC)检测周期性光信号的单光子，并确定激发脉冲后光子的时间。

信号的脉冲重复率高于光子检测率。因此每个信号周期检测到多个光子的可能性极小。每个信号周期只需要考虑一个光子。在这些条件下，可以在极高的分辨率下确定该光子的时间。

从单个光子的时间开始，TCSPC在激发脉冲后的时间内建立光子的分布。光子分布表示光信号的波形。见上图。

TCSPC还具有许多其他突出的功能。首先，它实现了近乎理想的光子效率：探测器看到的每个光子最终都会进入光子分布，从而对结果做出贡献。其次，TCSPC达到了极高的时间分辨率。分辨率不受探测器的单光子响应的限制，就像模拟记录技术一样。相反，分辨率由探测器中电子的传输时间抖动给出。这可能比单光子脉冲的宽度小10到50倍。例如，bh TCSPC器件在半峰时实现了小于20ps全宽的仪器响应函数（IRF）,其混合探测器的单光子响应宽度约为1ns。

TCSPC的经典原则插图1

bh TCSPC器件通过快速混合探测器

TCSPC的经典原则插图2

4.4ps IRF宽度，带单纳米线超导检测器

第三，使用bh TCSPC器件，即使是最快的IRF也可以在满足奈奎斯特的点密度下进行采样。由于时间通道宽度低至203fs，即使是最后一点时间信息也可以从记录信号中剔除。

第四，TCSPC达到了极高的动态范围和极高的线性度。实际上，动态范围受信号光子速率和背景计数率之比的限制。

TCSPC的经典原则插图3

在三个数量级上准确记录荧光衰减

高动态范围与高线性度相结合，使得分析多指数荧光衰减过程成为可能。对于生命科学中的应用来说，这是一个非常重要的特征：这些应用中的信息不直接存在于荧光衰变的表观时间中，而是存在于衰变的组成中，即衰变成分的持续时间和振幅。

多光子显微镜用飞秒激光器

上海星谱科技有限公司校译   021-80102555     info@star-spectrum.com

多光子显微镜技术的突破            

 

多光子显微镜无需染料或标签即可进行3D高分辨率成像，彻底改变了生物成像。这项技术的一个重要方面是使用非常短的飞秒脉冲。这些脉冲的使用有几个优点，使多光子显微镜成为研究生物样品是有价值的工具。

  1. 多光子显微镜使用飞秒脉冲减少了对样品的光损伤。短脉冲最大限度地减少了曝光时间，减少了在成像过程中发生的光损伤量。这在活体样本的研究中尤为重要，因为它允许研究人员在不影响样本活力的情况下获得高分辨率图像。

多光子显微镜用飞秒激光器插图肺组织的多光子显微镜图像。阿姆斯特丹大学Groot Vrije教授有限公司

 

  1. 使用飞秒脉冲提高了双光子荧光的效率。这些脉冲的高峰值功率增强了非线性相互作用，从而提高了荧光效率。这使得研究人员可以用更少的光子获得高分辨率的图像，减少了对高激光功率的需求，并最大限度地减少了光损伤。

 

  1. 此外，飞秒脉冲在多光子显微镜中提供了改进的空间分辨率。脉冲持续时间短，峰值功率高，可实现3D高分辨率成像，使研究人员能够在细胞和亚细胞水平上研究样品。

 

超短脉冲持续时间的优势:低于50fs

由于多光子激发的效率很大程度上取决于脉冲期间入射光的峰值功率，因此脉冲越短，峰值功率越高，产生的多光子信号就越强。到目前为止，产生低于80fs极限的超短洁净脉冲的能力相对有限。

 

VALO fs激光系列提供了一种新的方法来克服这一限制，产生更短(低于50秒)和洁净的脉冲。图1显示了双光子和三光子效率与脉冲持续时间的关系[1,2]。多光子事件的效率与激光峰值功率呈非线性关系，对于两个和三个光子过程，相应的信号分别随入射光峰值功率的平方和立方而增加。例如，将脉冲持续时间从200秒减少到50秒，峰值功率增加4倍，双光子效率增加4倍，而三光子效率增加16倍。

多光子显微镜用飞秒激光器插图1图1:二光子和三光子效率与脉冲持续时间的关系

 

然而，为了在实验中应用这种关系，必须准确地确定样品中的脉冲持续时间。如果显微镜中的光学色散没有得到适当的补偿，脉冲将被拉伸，并且在样品上测量到较低的峰值功率。在这种情况下，脉冲持续时间与高次谐波产生效率之间的关系，无法通过实验精确验证。为了产生足够的非线性SHG和THG信号，在对样品温和的平均功率水平下实现所需的信噪比，必须使用低于50 fs的脉冲和色散预补偿。

 

图2a)显示了样品在VALO fs系列激光器的全带宽下，使用平均功率为4.7 mW的校准网格产生的三次谐波信号，产生~40 fs脉冲。在图2b)中，激光的光谱带宽被限制在10nm的FWHM，在1064 nm左右，产生~160 fs的脉冲。图2a)和图2b)的图像比例相同，但图2b)没有THG信号。只有将较长的~160 fs脉冲中的较低THG信号重新缩放后，才有可能获得高于实验噪声底限的图像，如图2c所示。在这种情况下，需要提高2.5倍的平均激光功率才能获得与更短的低于50 fs脉冲获得的THG信号相当的信噪比[3]。

多光子显微镜用飞秒激光器插图2

图2:带有50微米正方形的校准网格(Ibidi)的三次谐波。a) 4.7 mW，全谱短脉冲(<50 fs);VALO系列)。b) 6 mW，激光光谱限制在10 nm带宽(~160 fs)。c)将6mw激光光谱限制在10 nm带宽(~160 fs)下的对比度放大。

 

总之，在多光子显微镜中使用极短飞秒脉冲有几个优点，包括减少光损伤，提高效率，提高空间分辨率，减少背景信号。特别是，超短的低于50秒的脉冲提供了相当高的脉冲峰值功率，这使最佳的信噪比图像只需低得多的平均功率，这反过来减少光漂白，并延长细胞活力。这些优点使多光子显微镜成为研究生物样品的一种有价值的工具，使研究人员能够获得高分辨率。

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